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토마토 과실에서 CRSPR/Cas9 시스템 이용 LeMADS-RIN 유전자 편집에 의한 에틸렌 생산량 감소

Reduced Ethylene Production in Tomato Fruits upon CRSPR/Cas9-mediated LeMADS-RIN Mutagenesis
원예과학기술지 제36권 제3호, 2018.6, 396-405 (10 pages)
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초록
Recent progress in genome editing methods has opened new opportunities for reverse genetics-based studies in plants. The clustered regularly interspaced short palindromic repeat (CRISPR)/CRISPR-associated 9 endonuclease (CRISPR/Cas9) system is a novel strategy used to induce mutations in a specific genomic region of a variety of organisms including plants. Here, we described a high-frequency targeted mutagenesis utilizing Agrobacterium-delivered CRISPR/Cas9 in tomato. This system consists of an Agrobacterium binary vector and three guide RNAs for single gene targeting. We evaluated the system for its mutagenesis frequency and heritability using LeMADS-RIN gene of tomato. T0 transgenic events carrying mutations in the LeMADS-RIN gene occurred at rates over 10.6% mutants per transgenic event in both ‘Mamirio’ and ‘Golden Bell’ tomato genotypes. Three independent T₁ transgenic lines and wild-type (WT) tomato plants were used for ethylene analysis. Compared with WT plants, edited mutants exhibited more incompletely-ripening fruits and lower ethylene contents. Following genetic combination through segregation, null segregants carrying only the desired mutant alleles without the CRISPR transgene could be retrieved among the T₁ progeny. These Cas9/gRNA transgenic lines, therefore, can be used to convey the CRISPR-based mutagenesis by genetic cross to tomato lines that are not amenable to genetic transformation.

게놈편집 방법으로 최근 주목 받고 있는 CRISPR/CRISPR-associated 9 endonuclease(CRISPR/Cas9) 시스템은 식물에서 역유전학 기반 연구를 위한 새로운 기회가 되었으며, 특정 게놈 영역에서 돌연변이를 유발하는데 사용되는 새로운 전략으로 자리잡고 있다. 본 연구에서는 Agrobacterium법을 이용하여 CRISPR/Cas9 효소 및 sgRNA가 포함한 식물 벡터를 토마토 게놈에 도입하여 LeMADS-RIN 유전자의 게놈 편집을 유도하였다. 총 17개의 single copy가 도입된 형질전환체(T0)를 선발하여 sgRNA 영역의 PAM 영역 부근에서 T/A로 치환된 변이체, 1bp에서 최대 28bp의 결실 변이체를 선발하여 계통화하였다. 그 중 TG4, TG12와 TG26의 과실에서 에틸렌 생산량의 변화를 살펴본 결과 대조구에 비해 현저히 감소되었으며, 다양한 과색의 변이를 보였다. 따라서 이들 변이체 후대에서 CRISPR/Cas9을 포함한 T-DNA영역이 없는 null segregants을 선발하여 저장성이 좋은 토마토 육성에 이용할 수 있다.

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