수산물의 비타민 B₁₂ 분석을 위한 Pepsin-Assisted Extraction 및 Immunoaffinity-HPLC/DAD 분석법의 유효성 검증

문금주; 최용민; 천지연

doi:10.3746/jkfn.2018.47.2.168

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자료유형: 학술저널

저자정보: 문금주 (순천대학교) 최용민 (농촌진흥청) 천지연 (순천대학교)

저널정보: 한국식품영양과학회 한국식품영양과학회지 한국식품영양과학회지 제47권 제2호

발행연도: 2018.2

수록면: 168 - 175 (8page)

DOI: 10.3746/jkfn.2018.47.2.168

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한국은 삼면이 바다로 둘러 쌓여있어 연중 다양한 수산물이 식단에 활용되고 있기 때문에 수산물은 쇠고기나 돼지고기와 같은 육류 자원과 함께 한국 식단에서 비타민 B12 섭취를 위한 우수한 급원이 되고 있다. 식품 중의 비타민 B12는 단백질과 결합된 형태로 존재할 수 있으므로 국내 수산 자원의 비타민 B12 함량에 대한 신뢰도 있는 데이터베이스 구축을 위해서는 비타민 B12 추출법에 대한 검증이 필요하다. 따라서 본 연구에서는 매트릭스가 다른 수산물 4종(바지락, 꽃게, 고등어, 오징어)을 선정하여 pepsin을 이용한 비타민 B12 추출을 immunoaffinity column을 이용한 clean-up 및 HPLC/DAD 분석에 적용하는 분석법의 유효성을 검증하였다. 시료는 생물을 구입하여 가식 부위만 균질화한 다음 pepsin 처리 없이 추출된 자유 비타민 B12와 pepsin을 처리하여 결합된 비타민 B12를 포함한 총 비타민 B12 함량을 각각 분석하였으며, 이에 대한 분석법 검증(특이성, 민감성, 직선성, 정확성, 정밀성)을 수행하였다. 효소 처리 여부와 상관없이 특이적으로 cyanocobalamin을 분석할 수 있었으며 우수한 직선성(y=2008x－19.757, R²=0.9992)을 나타내었다. 검출한계(LOD)와 정량한계(LOQ)는 pepsin 무처리 시 각각 0.006과 0.061 μg/100 g을 나타내었으나 pepsin 처리 시 약 2배가 높은 0.015와 0.106 μg/100 g을 나타내었다. 인증참고물질 BCR-487(pig liver)을 분석한 회수율 측정에서 pepsin 처리가 99.4%, 무처리 추출이 96.3%로 효소 처리법이 다소 높은 회수율을 나타내었다. 정밀성 시험에서는 pepsin 무처리 추출의 반복성과 재현성이 각각 6.0과 10.5%, pepsin 처리 시 각각 9.4와 13.6%로 나타나 효소를 이용한 추출에서 정밀성이 더 높아지는 것으로 나타났다. 그러나 두 분석법 모두 AOAC에서 제안하는 수용 범위 수준을 충족하는 정확성과 정밀성을 나타내어 식품 중의 비타민 B12 분석에 적용 가능할 것으로 보인다. Pepsin 처리 추출법을 적용한 immunoaffinity-HPLC 분석법으로 4종 수산물(raw, wet basis)의 비타민 B12 함량을 분석한 결과, 바지락의 자유와 총 비타민 B12 함량은 각각 46.9와 55.2 μg/100 g으로 총 비타민 B12 함량이 유의적으로 높게 나타났으나(P<0.05), 꽃게와 오징어의 경우 각각 6.09~6.87 μg/100 g과 2.39~2.45 μg/100 g의 범위를 보이며 유의적인 차이를 나타내지 않았다. 이는 바지락과 고등어의 경우 총 비타민 B12 함량중에서 각각 약 18%와 20%가 단백질과 결합된 상태로 존재하는 것을 의미하며 이는 pepsin과 같은 효소를 이용한 추출법이 필요하다는 것을 가리킨다 하겠다. 또한, 본 연구의 LOD와 LOQ 결과는 pepsin 처리를 이용한 immunoaffinity-HPLC/DAD 분석법이 식품 중에 낮은 수준으로 존재하는 비타민 B12를 분석하는 데 적용 가능한 분석법임을 보여준다. Pepsin을 이용한 비타민 B12 분석은 정밀성과 정확성이 수용 범위 수준이기는 하지만 무처리 분석보다는 높기 때문에 다양한 수산 자원의 매트릭스에 따른 이들의 적용여부는 보다 구체적인 접근 방법을 검토해보는 것이 필요하다 생각된다.

Vitamin B12 exists in free and bound forms in foods. Use of proteolytic enzymes is recommended for vitamin B12 extraction from protein-rich foods, but information applicable to seafood is very limited. In this study, pepsin-assisted extraction (PE) coupled with immunoaffinity-HPLC/DAD (I/H/D) was validated and applied for determination of total vitamin B12 contents (sum of free and bound) in four types of seafood with different matrices (littleneck clam, blue crab, mackerel, and squid). PE-I/H/D showed good specificity and linearity (R²=0.9992). Limits of detection and quantification of PE-I/H/D were about twice as high (0.015 and 0.106 μg/100 g, respectively) as those of non-PE-I /H/D. Both PE- and non-PE-I/H/D showed good accuracy based on higher than 95% recoveries from the certified reference material, BCR-487. Precision of PE-I/H/D was acceptable based on AOAC guidelines, although it decreased upon application of PE (coefficient variations of repeatability and reproducibility: 9.4 and 13.6% for PE-I/H/D and 6.0 and 10.5% for non-PE-I/H/D, respectively). Free and total vitamin B12 contents of the four types of seafood were analyzed by using the validated PE-I/H/D. The total vitamin B12 contents of littleneck clam (55.16 μg/100 g) and mackerel (5.60 μg/100 g) were significantly higher than corresponding free vitamin B12 contents (46.91 and 4.64 μg/100g, respectively), indicating that 18∼20% of total vitamin B12 exists in bound form in littleneck crab and mackerel. On the other hand, there was no significant difference between free and total vitamin B12 contents in blue crab and squid within the ranges of 6.09∼6.87 and 2.39∼2.45 μg/100 g, respectively. The results of this study suggest that PE-I/H/D assay would be effective to release vitamin B12 from protein-rich seafood tissues and to produce acceptable selectivity, sensitivity, accuracy, and precision of vitamin B12 analysis, indicating PE-I/H/D is applicable for the determination of vitamin B12 at low levels in seafood.

#vitamin B< #SUB> #12< #/SUB> #pepsin-assisted extraction #seafood #method validation

참고문헌 (19)

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