Anti-Atherosclerotic action of Nelumbo nucifera seed extract and neferine isolated from embryo of Lotus seed : 연자추출물과 연심으로부터 분리한 네페린의 항동맥경화작용 :

문영준

학위논문

저자정보: 문영준 (목포대학교, 목포대학교 대학원)

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현재 임상에서 관상동맥의 협착에 의해 발생하는 협심증 및 심근경색의 치료를 위해 경피적관동맥형성술 및 스텐트삽입형성술이 시행되고 있으나 수술후 재협착에 의한 문제점이 크게 대두되고 있다. 풍선확장술에 의한 혈관내막의 상해는 MMP 활성의 증가에 의해 세포외기질의 분해를 통한 평활근세포의 내막으로 유주를 활성화하고 내막에서의 평활근세포의 증식이 내막비후를 초래하게 한다. In vivo 연구에서 연자의 에탄올 추출물이 rat 혈관상해 모델을 이용한 내막비후 동물실험에서 내막비후의 억제 효과에 유용하다는 것을 확인하였다. 따라서 이 후 연구에서는 연자의 다양한 분획이 평활근세포의 증식과 유주의 기능 조절에 관여하여 신생내막의 형성을 억제하는지에 대해 검토하고 in vitro 실험을 통해 평활근세포의 증식과 유주에 대한 생리활성이 뛰어난 분획을 확인한 뒤 선별된 분획을 HPLC를 이용 분석한 결과 bisbenzylisoquinoline 계열 알칼로이드인 neferine이 선별분획에 고농도로 농축되어있음에 주목하여 neferine의 평활근세포에 대한 증식과 유주 기능 조절작용에 대해 연구하였다 .
In vitro 실험에서 TNF-? 및 PDGF-BB처리에 의해 평활근세포의 증식과 유주는 MTT법과 transwell boyden chamber법으로 검정하였으며, TNF-? 를 처리한 HASMC와 A7r5 세포에 대한 세포주기의 진행과 cylclin D, cyclin E, CDK2, CDK4의 발현을 RT-PCR으로 측정하였으며, TNF-? 에 의한 HASMC의 MMP의 발현 억제 정도는 gelatin zymography와 western blot을 통해 확인 하였다. 또한 평활근세포 증식과 관련한 MAPK 경로의 신호전달 분자인 ERK1/2, JNK, p38와 NF-kB의 발현을 western blot을 이용하여 검증 하였다. Neferine의 Stress fiber 형성에 미치는 영향을 형광염색법을 통한 형광현미경을 사용하여 관찰하였다. In vitro실험에서 Neferine은 평활근세포 증식관련ERK1/2의 활성을 억제하고 NF-?B의 핵내 수송을 억제함으로서 cyclin D, cyclin E, CDK-4, CDK-2의 mRNA의 발현을 억제하였다. 이러한 결과로부터 Neferine은 세포주기에서 G0/G1단계의 진행을 제어함을 확인하였다. 그리고 Neferine은 평활근세포의 MMP-9 분비활성관련 단백인 JNK의 활성을 억제하고 NF-?B의 핵내 수송을 억제함으로서 MMP-9 분비활성억제를 통한 세포이동능을 감소시켰다. 이러한 결과로 미루어 보아 Neferine은 신생내막에서 평활근세포의 증식을 억제함과 동시에 유주관련 신호전달 억제와 더불어 평활근세포의 내막으로의 유주를 억제함으로써 혈관의 협착이 억제됨을 확인하였다. 또한 Neferine의 이러한 작용은 stress fiber의 형성과는 무관함을 확인하였다. 이러한 결과로부터 Neferine은 동맥경화 및 수술 후 재협착 억제 약물로의 개발에 선도화합물로서 주목이 되리라 본다.

Endovascular injury induced by balloon withdrawal leads to the increased activation of matrix metalloproteinases (MMPs) in the vascular wall allowing the proliferated vascular smooth muscle cells (VSMCs) to digest the surrounding extracellular matrix (ECM) and migrate from the media into the intima leading to the intimal thickening. This study was designed whether the alkaloid mainly neferine from the embryo of the seeds of N. nucifera involves in modulation of proliferation and migration of HASMCs to suppress the neo-intima formation. In in vivo study, seed of N. nucifera (400 mg/kg/body weight) was administered orally using gastric sonde for 28 days from the day of balloon injury. Morphometric analyses was carried out to determine the intimal thickening, stenosis rate and intimal/medial (I/M) ratio of injured carotid artery. In in vitro study, the effect of neferine and alkaloid rich fraction along with crude extract of seed of N. nucifera on tumor necrosis factor-alfa (TNF-?) induced proliferation and migration of human aortic smooth muscle cells (HASMCs) were carried out by using 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) assay and transwell boyden chamber method. TNF-? induced mRNA expression of cyclin D, cyclin E, cyclin dependent kinases (CDK-2 and CDK-4) in HASMCs and A7r5 were determined by reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR). Also, the effect on the expression of MMPs in TNF-? stimulated HASMCs was done by gelatin zymography and western blot analysis. The activation of signalling molecules like extracellular regulated kinase (ERK1/2), c-Jun N-terminal kinase (JNK) and p38, and translocation of nuclear factor kappa B (NF-?B) were determined by western blot analysis. Similarly, the stress fibers formation were determined by fluorescence microscope. Our in vitro assays revealed that neferine along with alkaloid rich fraction from the embryos of the seed of N. nucifera dose dependently inhibited proliferation of HASMCs by cell cycle arrest and inhibition of cyclin D, cyclin E, CDK-4 and CDK-2 mRNA expression through suppression of activation of ERK1/2 and NF-?B translocation. Also, neferine and the alkaloid rich fraction inhibited the migration of HASMCs by inhibition of MMP-9 through the inhibition of activation of JNK and NF-?B translocation. Our in vivo assays revealed that oral administration of seed of N. nucifera for 28 days significantly inhibited intimal area, I/M ratio and stenosis rate of rat carotid artery. Thus, the results suggest that seeds of N. nucifera can be considered as a therapeutic value in the prevention of atherosclerosis because restenosis after percutaneous transluminal coronary angioplasty (PTCA) is supposed to be ‘accelerated atherosclerosis’.

Key Words: neferine, HASMC, migration, PTCA, intimal thickening

#neferine #HASMC #migration #PTCA #intimal thickening

CONTENTS
[Abstract] 1
CHAPTER 1 INTRODUCTION 4
1.1 N.nucifera 4
1.2 Atherosclerosis and Restenosis 9
1.3 Proliferation and migration of Vascular smooth muscle cell 12
1.4 Oxidative stress and Atherosclerosis 15
1.5 Clinical trials of Atherosclerosis and Restenosis 16
1.6 Hypothesis and Objectives 16
CHAPTER 2 MATERIALS AND METHODS
2.1 Preparation of N.nucifera seed extract and alkaloid rich fraction
2.1.1 Fractionization 19
2.1.2 HPLC Analyses 20
2.2 Oxidation Assays
2.2.1 DPPH Scavenging Activity 21
2.2.2 Intracellular ROS Production 21
2.2.3 Serum Lipid Peroxidation (TBARS) 22
2.3 Proliferation Assays
2.3.1 MTT Assay 23
2.3.2 RT-PCR 23
2.4 Migration Assay
2.4.1 Boyden Chamber assay 26
2.4.2 Gelatin Zymography 27
2.4.3 Immunofluoroscene 28
2.5 Western blot Analysis 28
2.6 Balloon injury animal model
2.6.1 Balloon Endothelial Denudation 30
2.6.2 Histological Analyses 32
2.7 Statistical Analyses 32
CHAPTER 3 RESULTS
3.1 Effect of N. nucifera seed extract on Balloon injury animal model and HASMCs
3.1.1 Morphometric Analysis 33
3.1.2 Viability and TNF-α induced proliferation of HASMCs 37
3.1.3 Expression of MMPs 40
3.2 Effect of Alkaloid Rich Fractions on anti-oxidative activity and modulation of proliferation and migration of HASMCs
3.2.1 HPLC Analyses 42
3.2.2 Anti-oxidative activity 45
3.2.2.1 DPPH Scavenging Activity 45
3.2.2.2 Serum-Lipid peroxidation 47
3.2.3 Viability and TNF-α induced Proliferation of HASMCs 49
3.2.4 MMP-2 and MMP-9 Expression in HASMCs 52
3.2.5 Anti-migration activity (Boyden Chamber & MAPK Signalling molecules & NF-kB P65 Translocation 54
3.3 Effect of Neferine on anti-oxidative activity and modulation of proliferation & migration of HASMCs
3.3.1 Anti-oxidative activity 60
3.3.1.1 DPPH scavenging activity 60
3.3.1.2 Serum Lipid Peroxidation 62
3.3.1.3 Intracellular ROS production 64
3.3.2 Anti-proliferation activity of HASMCs 66
3.3.2.1 Viability and TNF-α induced proliferation of HASMCs 66
3.3.2.2 Cell Cycle Regulators 68
3.3.2.3 Effect of neferine on MAPK 70
3.3.2.4 Effect of Neferine on NF-kB p65 Translocation 71
3.3.2.5 Supression of ERK1/2 and NF-kB inhibits proliferation of HASMCs 73
3.3.2.6 Supression of ERK1/2 and NF-kB inhibits Cell Cycle Regulators of A7r5 76
3.3.3 Anti-migration activity of HASMCs 78
3.3.3.1 Neferine inhibits migration of HASMCs 78
3.3.3.2 MMP-2 and MMP-9 expression in HASMCs 80
3.3.3.3 Signalling molecules involved in the suppression of MMP-9 82
3.3.3.4 Stress fibers formation 84
CHAPTER 4 DISCUSSION 87
CHAPTER 5 CONCLUSION 96
REFERENCES 97
[국문초록] 108
[ACKNOWLEDGEMENT] 111

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