Protective role of C-peptide in diabetic vasculopathy through mechanism involving AMPK regulation of ROS cycling and mitochondrial dynamics : 당뇨성 혈관병증에서 Mitochondrial dynamics (변화)와 ROS cycling (순환)에 관한 AMPK 조절 기작을 통한 C-peptide의 방어적 역할 :

Bhatt, Mahendra Prasad

자료유형: 학위논문

저자정보: Bhatt, Mahendra Prasad (강원대학교, 강원대학교 대학원)

지도교수: 하권수

발행연도: 2013

저작권: 강원대학교 논문은 저작권에 의해 보호받습니다.

이용수0

초록· 키워드

C-peptide는 당뇨병 합병증에서 방어 역할을 하는 bioactive peptide이다. 그러나 C-peptide의 심혈관 손상에 대한 방어 기작은 아직 불분명하다. 고혈당으로 유도된 내피세포의 손상은 당뇨병 혈관 병리학에서 1차 적인 원인이다. 따라서 우리는 혈관내피세포와 당뇨병 쥐를 이용하여 고혈당으로 유도된 세포사멸에 대한 C-peptide의 잠재적 역할을 조사하였다. 내피세포에서 고혈당에 의해 유도된 apoptotic 세포 사멸은 Transglutaminase 2(TG2)의 연속적인 활성과 세포 내 Ca2+, ROS 의 연속적인 증가로 인하여 일어난다. C-peptide는 Protein kinase C 와 NADPH 산화효소 의존적인 세포 내 ROS 생성 의 억제와 세포 내 Ca2+ 양의 영향 없이 고혈당에 의해 유도는 TG2 활성을 없애 버림으로 써 내피 세포의 사멸을 막는다. 따라서 당뇨병 쥐의 대동맥에서 고혈당이 유도한 transamidating 활성과 내피 세포의 사멸을 Osmotic pump 를 이용한 C-peptide 대체 요법으로 막을 수 있다. 게다가 c-peptide는 당뇨병 쥐의 신장 피질과 심장에서 일어나는 고혈당이 유도한 transamidating 활성과 세포사멸을 막을 수 있다. 비록 고혈당증에서 ROS 생성 과정은 미토콘드리아와 세포기질 (cytosol) 에서 생성된다고 보고 되었지만, 우리는 세포기질성 (Cytosolic) NADPH 산화효소 의존성 superoxide (초과산화물) 이 미토콘드리아의 superoxide 생성을 증가시키고 따라서 미토콘드리아의 분열이 야기된다고 제시하였다. 미토콘드리아의 ROS 증가와 함께 일어나는 미토콘드리아 분열 기작은 순환과정에서 ROS의 증폭을 가능하게 하고 이러한 현상은 내피 세포의 세포사멸을 유도한다. 이것과 관련하여 우리는 5` AMP-activated protein kinase (AMPK) 활성을 통한 ROS 증폭을 막는 새로운 C-peptide 기작에 관하여 실험하였다. C-peptide 신호전달에 관련된 이 기작은 고혈당에 의해 유도된 미토콘드리아 dynamics 와 막전위의 변화를 회복시키고 내피세포의 사멸을 막는다. 따라서, C-peptide는 AMPK를 활성화시켜 ROS cycle과 미토콘드리아의 변화를 조절함으로 써 고혈당으로 인한 손상으로 발생하는 내피 세포의 사멸을 막아 당뇨성 혈관병증을 막는다.

C-peptide is a bioactive peptide with a protective role in diabetic complications; however, its molecular mechanism of protection against cardiovascular damage remains unclear. Hyperglycemia-induced endothelial damage is the primary cause of vascular pathologies. Therefore, we investigated the potential role of C-peptide against hyperglycemia-induced apoptosis using human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) and diabetic mice. High glucose induced apoptotic cell death in endothelial cells via sequential elevation of intracellular Ca2+ and ROS as well as subsequent activation of transglutaminase 2 (TG2). C-peptide prevented endothelial cell death by inhibiting protein kinase C- and NADPH oxidase-dependent intracellular ROS generation and by abolishing high glucose-induced TG2 activation, without affecting intracellular Ca2+ levels. Consistently, in the aorta of diabetic mice, hyperglycemia stimulated transamidating activity and endothelial cell apoptosis that was inhibited by C-peptide replacement therapy using osmotic pumps. In addition, C-peptide prevented hyperglycemia-induced activation of transamidating activity and apoptosis in the heart and renal cortex of diabetic mice. Although the process of ROS production in hyperglycemia has been reported either by its production through mitochondria or cytosol, we proposed cytosolic NADPH oxidase-dependent superoxide enhance mitochondrial superoxide production thereby induce mitochondrial fission. Mitochondrial fission machinery with mitochondrial ROS increase further may potentiate ROS amplification in a cyclic process, and these events cause endothelial cell apoptosis. In this regards, we explored novel mechanism of C-peptide that prevents triggering of ROS amplification through the activation of 5’ AMP-activated protein kinase (AMPK). This mechanism of c-peptide signaling restores hyperglycemia-induced altered mitochondrial dynamics and mitochondrial membrane potential, and prevents endothelial cell death. Thus, C-peptide protects against diabetic vasculopathy by protecting endothelial cells from hyperglycemic damage through activation of AMPK, thereby regulation of ROS cycle and altered mitochondrial dynamics.

#C-peptide #Diabetes #Vascular complications #AMPK

I. INTRODUCTION 12
1. Human C-peptide 12
2. C-peptide deficiency in Diabetes mellitus 14
3. Diabetic complications 15
4. Benificial role of C-peptide in diabetes diabetic complications 16
II. LITERATURE REVIEW 18
1. Pathophysiology of cardiovascular disease 18
2. Endothelial cell apoptosis and vascular pathology 19
3. Transglutaminase 2 and Diabetes complications 20
4. Amplification of ROS and mitochondrial fission 20
5. AMPK activation as a potential therapeutic approach 22
6. Clinical potential of C-peptide replacement therapy in diabetes 23
III. MATERIAL AND METHODS 26
1. Chemicals and reagents 26
2. Cell culture 27
3. Cell death assay 27
4. Live-cell imaging for intracellular and mitochondrial ROS measurement 29
5. Measurement of intracellular Ca2+ levels 29
6. Measurement of in situ transamidating activity in HUVECs 30
7. Mitochondrial staining and analysis of mitochondrial fission 31
8. Measurement of mitochondrial membrane potential 31
9. Transfection of small interfering RNA 32
10. Western blot analysis 33
11. Generation of diabetes mouse model and C-peptide treatment using osmotic pumps 34
12. Tissue collection 35
13. Measurement of transamidating activity in tissues 35
14. Tissue TUNEL assay 36
15. Measurement of ROS generation and mitochondrial fission in aortic endothelium of mice 37
16. Western blot for mice aortic tissue homogenate 38
17. Statistics 38
IV. RESULT 39
1. C-peptide inhibits high glucose-induced apoptosis 39
2. Roles of intracellular ROS and Ca2+ and TG2 in high glucose-induced cell death 40
3. Prevention of high glucose-induced generation of Intracellular ROS 42
4. Intracellular Ca2+ acts upstream of intracellular ROS and is unaffected by C-peptide 44
5. C-peptide regulates TG2 activity by inhibiting high glucose-induced ROS generation 46
6. Ex vivo treatment of C-peptide in aortic segments of streptozotocin diabetic mice inhibits hyperglycemia-stimulated transamidating activity 49
7. C-peptide replacement therapy inhibits hyperglycemia-induced activation of transamidating activity and prevents apoptosis in aortic endothelium of streptozotocin diabetic mice 51
8. C-peptide prevents hyperglycemia-induced activation of transamidating activity and apoptosis in heart and renal cortex of streptozotocin diabetic mice 54
9. High glucose-induced cytosolic reactive oxygen species (ROS) facilitates mitochondrial ROS increase 57
10. High glucose-induced mitochondrial ROS also enables cytosolic ROS increase 59
11. High glucose-induced cytosolic and mitochondrial ROS mediates mitochondrial fission 61
12. High glucose-induced ROS mediates mitochondrial membrane potential collapse 64
13. C-peptide inhibition of high glucose-induced ROS regulates mitochondrial fission and mitochondrial membrane potential collapse 66
14. AMPKα activation is essential for C-peptide action on attenuation of high glucose-induced ROS 69
15. C-peptide activation of AMPKα regulates high glucose-induced mitochondrial fission and mitochondrial membrane potential collapse 72
16. AICAR and metformin showed C-peptide mimetic regulation of high glucose-induced endothelial damage 74
17. C-peptide activation of AMPKα and subsequent inhibition of ROS-mediated mitochondrial fission regulates high glucose-induced endothelial cell apoptosis 77
18. C-peptide replacement therapy promotes AMPKα activation instreptozotocin diabetic mice aorta 81
V. DISCUSSION 86
VI. REFERENCES 96
VII. ABSTRACT (in Korean) 108
VIII. ACKNOWLEDGEMENT 110
LIST OF TABLES
Table 1. In vivo clinical data from streptozotocin diabetic mice, C-peptide-supplemented diabetic mice, and age-matched non-diabetic mice 52
LIST OF FIGURES
Fig. 1. Human C-peptide, 31-amino acid sequence in intact pre-proinsulin 13
Fig. 2. Consequences of hyperglycemia-induced activation of PKC 19
Fig. 3. C-peptide and inhibitors of intracellular ROS, Ca2+ and TG 2 inhibit high glucose-induced apoptotic cell death in HUVECs 39
Fig. 4. TG2 siRNA prevents high glucose-induced apoptotic cell death 41
Fig. 5. High glucose-induced generation of intracellular ROS is prevented by various inhibitors 43
Fig. 6. C-peptide inhibits high glucose-induced ROS generation but has no effect on intracellular Ca2+ 45
Fig. 7. High glucose-induced activation of TG2 is inhibited by various inhibitors or C-peptide 48
Fig. 8. C-peptide inhibits hyperglycemia-induced stimulation of transamidating activity and apoptosis in mice aortic segments 50
Fig. 9. C-peptide inhibits hyperglycemia-induced stimulation of transamidating activity and apoptosis in mice aortic segments 53
Fig. 10. C-peptide inhibits hyperglycemia-induced stimulation of transamidating activity and apoptosis in heart and renal cortex 55
Fig. 11. Proposed mechanism for C-peptide prevention of hyperglycemia-induced endothelial apoptosis via inhibition of ROS-mediated TG2 activation 56
Fig. 12. Blocking cytosolic mitochondrial ROS generation attenuates high glucose-induced cellular ROS amplification 58
Fig. 13. Blocking mitochondrial ROS generation attenuates high glucose-induced cellular ROS amplification 61
Fig. 14. Essential role of cytosolic and mitochondrial ROS in high glucose (HG)-induced mitochondrial fission and mitochondrial membrane potential collapse in HUVECs 63
Fig. 15. Role of cytosolic and mitochondrial ROS in high glucose (HG)-induced mitochondrial membrane potential collapse in HUVECs 65
Fig. 16. C-peptide regulation of high glucose-induced cellular ROS amplification prevents mitochondrial fission and mitochondrial membrane potential collapse 68
Fig. 17. Activation of AMPKα is essential for C-peptide regulation of high glucose-induced cellular ROS accumulation in endothelial cells 71
Fig. 18. Activation of AMPKα is also essential for C-peptide regulation of high glucose-induced, mitochondrial fission and mitochondrial membrane potential collapse in endothelial cells 73
Fig. 19. AMPK activator AICAR and metformin inhibits high glucose (HG)-induced ROS amplification, mitochondrial fission and mitochondrial membrane potential collapse 75
Fig. 20. AMPK activator AICAR and metformin showed C-peptide mimetic inhibition of high glucose (HG)-induced apoptosis 80
Fig. 21. C-peptide replacement therapy activates AMPKα in aorta of diabetic mice 83
Fig. 22. Schematic modfel of C-peptides rle in regulating hyperglycemia-induced vasculpathy through AMPK-dependent mechanism 85

최근 본 자료

전체보기

구분	그룹	데이터 항목
AI 학습용 데이터	원문	원문 PDF 파일
AI 학습용 데이터	원문 + 메타 (기본/상세)	원문 PDF 파일 및 서지정보 CSV
대량 구매용 데이터	B2B 구독 방식	특정 자료 한정으로 원문 접근 권한 부여
대량 구매용 데이터	URL 전달 방식	바로 PDF 뷰어를 열람할 수 있는 URL 제공

구분	그룹	데이터 항목
AI 학습용 데이터	기본 메타	발행기관명, 간행물명, 권호명, 권(vol), 호(issue), 통권, 발행연도, 발행월, 논문명, 저자명, 시작페이지, 종료페이지, 전체페이지, 상세페이지URL
상세 메타 데이터	발행기관 메타	발행기관 이명, 영문명, 창립연도, 홈페이지URL, 발행기관 소개
	간행물 메타	부제목, 간행물 유형, ISSN, ISBN, 최초발행연도, 폐간연도, 간행빈도, 발행주기, 등재사항, 이용수, 피인용수, 권호수, 논문수, 표지이미지
	논문 메타	작성 언어, 부제목, 대등제목, 목차, 키워드, 초록, 이미지, 참고문헌, 이용수, 피인용수, 논문활용도, DBpia통합주제분류, KDC분류, DDC분류, 한국연구재단분류, UCI, DOI
	저자 메타	소속기관, 소속부서, 직급, 연구분야, 연구키워드, 이용수, 피인용수, 저자 논문활용도

구분	그룹	데이터 항목
※ 결합형/맞춤형 메타 데이터는 신청 내용에 따라 다양하게 제공 가능
이용순위 정보	주제분야별 많이 이용된 논문	“인문학”에서 많이 이용된 논문 TOP100
	이용기관별 많이 이용된 논문	“중고등학교”에서 많이 이용된 논문 TOP100
	세부기관별 많이 이용된 논문	“서울대학교”에서 많이 이용된 논문 TOP100
	키워드별 많이 이용된 논문	“Chat GPT”에서 많이 이용된 논문 TOP100
키워드 정보	많이 이용된 키워드	특정기간/분야/저널 내 많이 이용된 키워드
	많이 발행된 키워드	특정기간/분야/저널 내 많이 발행된 키워드
	많이 검색된 키워드	특정기간/분야/저널 내 많이 검색된 키워드
	연구 트렌드 키워드	특정 키워드 연관 연구동향 분석 데이터 키워드

논문 기본 정보

초록· 키워드

목차

최근 본 자료

댓글(0)