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논문 기본 정보
- 자료유형
- 학위논문
- 저자정보
- 지도교수
- 安相洛
- 발행연도
- 2013
- 저작권
- 충남대학교 논문은 저작권에 의해 보호받습니다.
이용수13
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이차원 전기영동 분석을 이용하여 국내 밀 32 품종의 HMW-GS 단백질 발현의 정성 및 정량적인 분석을 통해 품종별 HMW-GS 발현 정도를 평가하여 국내 밀 품종 육성의 기초 자료로 활용하고자 수행하였다. 평균 HMW-GS 스팟 수는 11.78개였으며, Glu-A1 1.31개, Glu-B1 5.53개, 그리고 Glu-D1에서 4.94 개였다. Glu-B1과 Glu-D1에서는 subunit에 따른 단백질 스팟 수가 차이가 없기 때문에, Glu-A1에서는 1과 2* subunit을 지닌 품종이 null allele 품종에 비하여 단백질 스팟 수가 많았다. 단백질 스팟 수는 조경밀이 18개로 가장 많았으며, 다홍밀은 7개로 제일 적었다. 단백질의 상대적인 발현량을 조사한 결과 평균 0.44로 대비 품종인 Chinese Spring에 비하여(1.0) 낮았고, 고분밀이 1.11로 가장 높았으며, 은파밀이 0.24로 가장 낮았다. 단백질 스팟수와 발현량을 이용한 유연관계 분석 결과, 국내 밀 품종을 6개 그룹으로 분류할 수 있었다.
한국 밀 품종 “우리”의 HMW-GS 1Dx2.2 단백질을 일차원, 이차원 전기영동, LC-ESI MS/MS로 확인 동정하였고, 973개의 아미노산을 암호화하는 2919-bp의 ORF를 가지는 1Dx2.2 유전자를 분리하였다. 1Dx2.2 유전자는 전형적인 x-타입 HMW-GS 처럼 4개의 시스테인 잔기를 가졌다. 본 연구에서 분리한 “우리”의 1Dx2.2 염기서열과 이미 동정된 1Dx2.2 유전자들과 염기서열 분석한 결과 8개의 SNP를 보였고, 이중 4개는 아미노산 변화가 있었다. 1Dx2.2 단백질을 동정하기 위해서 “우리”에서 글루테닌 단백질을 추출하고 이차원전기영동을 실시하고 1Dx2.2 위치의 세개의 스팟을 LC-ESI MS/MS와 MASCOT 데이터베이스로 분석하였고 HMW-GS 1Dx2.2로 확인하였다. 또한 1Dx2.2 단백질을 FPLC로 성공적으로 분리하였다. 본 연구는 국내 최초로 한국 밀 품종 “우리”에서 HMW-GS를 분리 동정하고 순수 분리하였다.
밀 전체 단백질의 1/3 정도를 차지하는 LMW-GS는 글루텐의 신장성에 주로 관여하며, 밀의 가공적성에 중요한 영향을 미친다. 본 연구에서는 국내 밀 품종 육성의 기초 자료로 활용하기 위해서 이차원전기영동 분석을 통하여 LMW-GS 발현 정도를 정성 및 정량적으로 분석하였다. 국내 밀 32 품종의 LMW-GS 2DE reference map은 품종 구별을 위한 바이오 마커로 사용될 수 있고, Glu-3 유전자좌에 해당하는 스팟들을 확인하였다. 또한 6배체 밀 특이적인 스팟들을 확인하였다. 국내 밀품종의 LMW-GS 이차원전기영동 총 스팟 수는 10개에서 20개의 분포를 보였고 평균 17.13개 였다. Glu-A3 유전자좌에서 평균 3.0, Glu-B3 평균 4.56개 그리고 Glu-D3 유전자좌에서 평균 2.96개의 스팟이 발현되었다. 국내 밀 품종의 상대적인 발현량의 평균은 0.67로 표준 품종인 Chinese Spring에 비하여 낮았으며, 고분밀이 1.32로 가장 높았으며, 백중밀이 0.29로 가장 낮았다. 단백질 스팟수와 발현량을 이용한 유연관계 분석을 통하여 국내 밀 품종을 5개 그룹으로 분류할 수 있었다.
미성숙 종자로부터 추출된 전체 RNA를 이용하여 합성한 cDNA와 LMW-GS 특이 프라이머세트를 이용하여 43개의 LMW-GS 유전자를 분리하였다. 각각의 유추 아미노산은 상동성이 높은 20개의 시그널 펩타이드, N-말단 영역, 반복서열 영역 그리고 C-말단 영역을 가지며 C-말단 영역에 분자 내 혹은 분자간 이황화 결합을 형성하는 전형적인 8개의 시스테인을 가지고 있었다. 이들 시스테인의 위치는 첫번째, 일곱번째를 제외하고는 보존되어 있었다. Ikeda 분류법과 비교할 경우, 이들은 각각 그룹 1, 2, 3 또는 4, 5, 7, 10(이중 그룹 2와 5가 가장 많음) 그리고 11에 속하며 그룹 6, 8, 9 그리고 12 에 속한 단백질은 탐지되지 않았다. 이들 4개 LMW-GS 유 전자들을 Lasergene Version 7.0을 이용하여 DNA 염기서열 수준에서 계통도를 분석한 결과 Ikeda 그룹의 분류법과 일치하였다. 단백질 수준에서 LMW-GS들을 확인하기 위해 2DE 로 이들 단백질을 분리하여 이들의 N-말단 아미노산 서열을 분석하였다. 7개 스팟의 N-말단 아미노산 서열을 확인할 수 있었고 이중 2개는 N-말단 아미노산 서열이 세린으로 시작하는 LMW-s 타입이었고 5개는 N-말단 아미노산 서열이 메티오닌으로 시작하는 LMW-m 타입이었다. 이들 서열은 Ikeda그룹의 분류법에 따르면 그룹 1, 2, 3, 3/4, 5 그리고 10이었다. 이들 LMW-GS 단백질 중 2개는 Glu-D3 그리고 3개는 Glu-B3에 의해 encoding 되었고 나머지는 확인이 불가능 하였다. 그룹 6, 7, 8, 9, 11, 그리고 12의 스팟은 확인할 수 없었다. N-말단 아미노산 서열들과 클로닝된 LMW-GS 유전자군을 비교해 보면 그룹 1, 2, 3/4, 5 그리고 10이 모두 유전자와 단백질 수준에서 존재하고 있음을 확인하였다. 본 연구는 다양한 LMW-GS 유전자들을 분리, 동정하였고 이들의 해당 단백질을 확인할 수 있었다. 이러한 결과는 밀가루 품질 향상을 위한 육종 프로그램에 도움이 될 것이다.
국내 밀 품종 조경, 금강 그리고 중국 밀 품종인 Chinese spring의 genomic DNA를 주형으로 LMW-GS 특이 프라이머세트를 이용하여 3개의 새로운 LMW-GS i 타입 유전자를 분리하였고 이들의 분리된 유전자는 각 각 조경 II-2, CS III-5 그리고 금강 6-12로 명명하였다. 이들의 유추 아미노산을 분석한 결과 20개의 시그널 펩타이드, 이소루신으로 시작하는 N-말단 부분 그리고 글루타민이 많은 반복도메인 그리고 C-말단 부분으로 구성되어 있으며 조경 II-2와 CS III-5는 전형적인 LMW-GS i-type 유전자처럼 C-말단에 8개의 시스테인 잔기가 있었다. 금강 6-12는 특이하게도 하나 더 많은 9개의 시스테인 잔기가 존재하였는데 이 여분의 시스테인 잔기는7번째 시스테인 잔기의 11잔기 앞에 존재하며 TAT(타이로신)이 TGT(시스테인)로 바뀐 결과이다. LMW-i 타입 글루테닌 유전자들 간의 SNP와 InDel을 확인하기 위해서 본 연구에서 클로닝 된 조경 II-2, CS III-5 그리고 이전에 본 그룹에서 확인된 조경 HQ619933와 기존 문헌에 나와 있는 6배체 밀 유래의 10개의 LMW-GS i 타입 유전자들과 다중염기서열 분석을 실시하였고, 이들 사이에서 15개의 SNP와 1개의 insertion이 확인되었다. 밀 품종 조경의 Glu-A3 단백질을 동정하기 위해 글루테닌을 추출 이차원전기영동을 하고 Glu-A3c 위치의 스팟을 절취하여 in-gel digestion한 후 LC-ESI MS/MS 분석을 수행한 결과 조경의 i 타입 LMW-GS 유전자좌는 Glu-A3c로 확인되었다. LMW-i 타입 글루테닌 유전자들의 연관 관계를 분석하기 위해 본 연구 그룹에서 클로닝 한 조경 II-2, CS III-5, 금강 6-12 그리고 조경 Q6199333와 Genebank DB의 35개의 LMW-i 타입 글루테닌 유전자의 유추 아미노산 서열을 이용하여 Phylogenic tree를 완성하였다. 이들 39개의 계통도 분석 결과 이배체 밀과 4배체 밀의 LMW-i 타입 글루테닌이 육배체 밀의 LMW-i 타입 글루테닌과 크게 나눠지는 것을 확인하였으며, 육배체 밀의 LMW-i 타입 글루테닌들은 Glu-A3a부터 GluA-3g까지 7개 subgroup으로 나눠지는 것을 확인하였다. 금강 6-12는 GluA-3a와 GluA-3c 사이에 존재하였고 조경 II-2와 CS III-5는 GluA-3d와 일본 연질 밀인 농림 61의 AB062878과 같은 subgroup에 존재하였고 조경 HQ6199333은 Glu-A3c subgroup에 위치하였다. LMW-i 타입 글루테닌 유전자들의 유추 아미노산 다중서열분석결과 반복 도메인은 length polymorphism은 179～149개 정도의 long 타입과 91, 51, 10, 2개의 short 타입으로 나눠지고 이것은 long 타입과 short 타입 LMW-i 타입 글루테닌 유전자를 구분 할 수 있는 마커로 이용 가능하다.
To evaluate qualitative and quantitative expression level of HMW-GS protein, we separated glutenin fractions and conducted two-dimensional electrophoresis (2DE) in 32 Korean wheat cultivars. The average spot number of HMW-GS in Korean wheat cultivars was 11.78 which included 1.31, 5.53 and 4.94 spots at Glu-A1, Glu-B1 and Glu-D3 loci, respectively. Cultivars harboring 1, 2* subunits had more spots than ones with null allele in Glu-A1 locus because Glu-B1 and Glu-D3 loci did not show difference in spot number. A large variation in the total spot number of HMW-GS was observed ranging from 7 (Dahong) to 18 (Jokyung). Relative expression level of Korean wheat cultivars when compared with the check accession Chinese Spring ranged from 24% (Eunpa) to 111% (Gobun) with an average of 44%. Korean wheat accessions could be classified into six groups based on the number of HMW-GS spots and quantification value of each spot.
The high-molecular-weight glutenin subunit (HMW-GS) 1Dx2.2 from the Korean wheat cultivar ‘Uri’ was identified and characterized by one and two dimensional gel electrophoresis, and by liquid chromatography electrospray ionization-tandem mass spectrometry (LC-ESI MS/MS). The amplified coding region of this gene was also cloned and sequenced. Molecular characterization of the 1Dx2.2 gene revealed an open reading frame of 2919-bp encoding a polypeptide of 973 amino acids. In addition, the number of cysteines is four compared to that of a typical x-type HMW-GS which has four cysteines. A sequence comparison of the 1Dx2.2 allele in Uri with previously characterized 1Dx2.2 alleles revealed 8 single nucleotide polymorphisms, among which four SNPs were found to be non-synonymous. To confirm the authenticity of the 1Dx2.2, extracted glutenin proteins were separated by two dimensional gel electrophoresis and analyzed by mass spectrometry. Three spots were observed in the 1Dx2.2 position and were identified as HMW-GS 1Dx2.2 by LC-ESI MS/MS and a MASCOT database search. We successfully purified 1Dx2.2 to a single band by fast protein liquid chromatography (FPLC). This is first report on the molecular cloning and characterization of the HMW-GS 1Dx2.2 in a Korean wheat variety and purification of its protein product.
LMW-GSs represent approximately 1/3 of the total wheat gluten fraction. Even though they are important in the context of wheat end-use quality, they have not been widely studied. In this study, we report on the qualitative and quantitative analysis of LMW-GS in 32 Korean wheat cultivars by 2DE to provide basic information for wheat breeding. We firstly identified spots corresponding each of the Glu-3 alleles. The 2DE results for each cultivar will be used as reference map or protein marker discriminating among wheat cultivars, and imported and Korean flour. It is notable that five LMW-GS spots detected at a common position were hexaploid-specific. It remains to be clarified what function in glutenin biosynthesis these spots might play. The total spot number ranged between 20 and 10, and the average spot number was 17.12. The average number of spots in Glu-A3, Glu-B3 and Glu-D3 were 3.0, 4.56 and 2.96 respectively. Korean wheat cultivars were compared with the Chinese spring (1.0) in the average relative expression level, and the average was low as 0.67. Gobun was the highest as 1.32 and Baekjoong was the lowest as 0.24. Korean wheat could be classified into five groups based on the genetic distance using the frequency of HMW-GS spots and quantification value of each spot.
Low-molecular-weight glutenin subunit (LMW-GS) in common wheat is important for quality processing of bread and noodles. The objectives of this study were to clarify the composition of LMW-GSs and to identify their corresponding proteins. Using LMW-GS specific primers we cloned and characterized 43 LMW-GS genes in the wheat cultivar ‘Jokyoung’. Some of these genes contain polypeptides different in size due to the presence of various deletions or insertions within repetitive and glutamine-rich domains. The comparison of deduced amino acid sequence of the LMW-GS genes in Jokyoung with that of 12 groups LMW-GSs of wheat cultivar Norin 61 showed that the deduced amino acid sequences were nearly the same to LMW-GS groups of 1, 2, 3/4, 5, 7, 10 and 11. All LMW-GS genes contain eight cysteine residues, which are conserved among all of the typical LMW-GS sequences. The relative positions of cysteine residues are also conserved, except those of the first and seventh. Based on phylogenetic analysis, the 43 sequences with the same N-terminal and C-terminal amino acid sequences were clustered in the same group. To identify the proteins containing the corresponding amino acid sequences, we determined the N-terminal amino acid sequence of 7 spots of LMW-GSs of Jokyoung separated by two-dimensional gel electrophoresis (2DE). Of them, Glu-B3 (LMW-m and LMW-s) and Glu-D3 (LMW-m) were detected in two and three spots, respectively and the others were not clear. Collectively, we classified diverse LMW-GSs and identified their corresponding protein products. These results will be helpful in breeding programs for improvement of wheat flour quality.
Three low molecular weight (LMW) glutenin subunit genes were isolated from hexaploid wheat cultivars (Triticum aestivum. L) using LMW-GS specific primers and designated as Jokyung II-2, CS III-5 and Keumkang 6-12, respectively. All sequences were classified as LMW-i type genes based on the presence of an N-terminal isoleucine residue. All comprised of four regions, the signal peptide, N- and C- terminal domains, and a repetitive domain. Although they showed high similarity with other LMW-i type genes from hexaploid bread wheat, they also displayed unique features. Particularly, Keumkang 6-12 subunit contained an extra cysteine residue in the C-terminus except for eight conserved cysteines, which resulted from a single-nucleotide polymorphism (SNP) of the A?G transition, namely tyrosine-cysteine substitution at position 335 from the N-terminal end. In addition, a total of 15 SNPs and one insertions/deletions (InDels) were detected among Jokyung II-2, CS III-5 and Jokyung HQ6199333 and 10 other LMW-i genes. Two dimensional gel electrophoresis and LC-ESI MS/MS analysis revealed that LMW i-type glutenin subunit of the Jokyung is Glu-A3c. The phylogenic analysis showed that LMW i-type genes were divided roughly into diploid and hexaploid groups and the hexaploid were further classified into 7 subgroups (Glu-A3a~g). We also found length polymorphism in the repetitive domain showing 2~179 amino acid residues variation among the previously published LMW-I type glutenin subunits. The length polymorphism can be used as reliable genetic marker for use in marker-assisted breeding to select for specific alleles of the quality-determining locus in wheat breeding program.
한국 밀 품종 “우리”의 HMW-GS 1Dx2.2 단백질을 일차원, 이차원 전기영동, LC-ESI MS/MS로 확인 동정하였고, 973개의 아미노산을 암호화하는 2919-bp의 ORF를 가지는 1Dx2.2 유전자를 분리하였다. 1Dx2.2 유전자는 전형적인 x-타입 HMW-GS 처럼 4개의 시스테인 잔기를 가졌다. 본 연구에서 분리한 “우리”의 1Dx2.2 염기서열과 이미 동정된 1Dx2.2 유전자들과 염기서열 분석한 결과 8개의 SNP를 보였고, 이중 4개는 아미노산 변화가 있었다. 1Dx2.2 단백질을 동정하기 위해서 “우리”에서 글루테닌 단백질을 추출하고 이차원전기영동을 실시하고 1Dx2.2 위치의 세개의 스팟을 LC-ESI MS/MS와 MASCOT 데이터베이스로 분석하였고 HMW-GS 1Dx2.2로 확인하였다. 또한 1Dx2.2 단백질을 FPLC로 성공적으로 분리하였다. 본 연구는 국내 최초로 한국 밀 품종 “우리”에서 HMW-GS를 분리 동정하고 순수 분리하였다.
밀 전체 단백질의 1/3 정도를 차지하는 LMW-GS는 글루텐의 신장성에 주로 관여하며, 밀의 가공적성에 중요한 영향을 미친다. 본 연구에서는 국내 밀 품종 육성의 기초 자료로 활용하기 위해서 이차원전기영동 분석을 통하여 LMW-GS 발현 정도를 정성 및 정량적으로 분석하였다. 국내 밀 32 품종의 LMW-GS 2DE reference map은 품종 구별을 위한 바이오 마커로 사용될 수 있고, Glu-3 유전자좌에 해당하는 스팟들을 확인하였다. 또한 6배체 밀 특이적인 스팟들을 확인하였다. 국내 밀품종의 LMW-GS 이차원전기영동 총 스팟 수는 10개에서 20개의 분포를 보였고 평균 17.13개 였다. Glu-A3 유전자좌에서 평균 3.0, Glu-B3 평균 4.56개 그리고 Glu-D3 유전자좌에서 평균 2.96개의 스팟이 발현되었다. 국내 밀 품종의 상대적인 발현량의 평균은 0.67로 표준 품종인 Chinese Spring에 비하여 낮았으며, 고분밀이 1.32로 가장 높았으며, 백중밀이 0.29로 가장 낮았다. 단백질 스팟수와 발현량을 이용한 유연관계 분석을 통하여 국내 밀 품종을 5개 그룹으로 분류할 수 있었다.
미성숙 종자로부터 추출된 전체 RNA를 이용하여 합성한 cDNA와 LMW-GS 특이 프라이머세트를 이용하여 43개의 LMW-GS 유전자를 분리하였다. 각각의 유추 아미노산은 상동성이 높은 20개의 시그널 펩타이드, N-말단 영역, 반복서열 영역 그리고 C-말단 영역을 가지며 C-말단 영역에 분자 내 혹은 분자간 이황화 결합을 형성하는 전형적인 8개의 시스테인을 가지고 있었다. 이들 시스테인의 위치는 첫번째, 일곱번째를 제외하고는 보존되어 있었다. Ikeda 분류법과 비교할 경우, 이들은 각각 그룹 1, 2, 3 또는 4, 5, 7, 10(이중 그룹 2와 5가 가장 많음) 그리고 11에 속하며 그룹 6, 8, 9 그리고 12 에 속한 단백질은 탐지되지 않았다. 이들 4개 LMW-GS 유 전자들을 Lasergene Version 7.0을 이용하여 DNA 염기서열 수준에서 계통도를 분석한 결과 Ikeda 그룹의 분류법과 일치하였다. 단백질 수준에서 LMW-GS들을 확인하기 위해 2DE 로 이들 단백질을 분리하여 이들의 N-말단 아미노산 서열을 분석하였다. 7개 스팟의 N-말단 아미노산 서열을 확인할 수 있었고 이중 2개는 N-말단 아미노산 서열이 세린으로 시작하는 LMW-s 타입이었고 5개는 N-말단 아미노산 서열이 메티오닌으로 시작하는 LMW-m 타입이었다. 이들 서열은 Ikeda그룹의 분류법에 따르면 그룹 1, 2, 3, 3/4, 5 그리고 10이었다. 이들 LMW-GS 단백질 중 2개는 Glu-D3 그리고 3개는 Glu-B3에 의해 encoding 되었고 나머지는 확인이 불가능 하였다. 그룹 6, 7, 8, 9, 11, 그리고 12의 스팟은 확인할 수 없었다. N-말단 아미노산 서열들과 클로닝된 LMW-GS 유전자군을 비교해 보면 그룹 1, 2, 3/4, 5 그리고 10이 모두 유전자와 단백질 수준에서 존재하고 있음을 확인하였다. 본 연구는 다양한 LMW-GS 유전자들을 분리, 동정하였고 이들의 해당 단백질을 확인할 수 있었다. 이러한 결과는 밀가루 품질 향상을 위한 육종 프로그램에 도움이 될 것이다.
국내 밀 품종 조경, 금강 그리고 중국 밀 품종인 Chinese spring의 genomic DNA를 주형으로 LMW-GS 특이 프라이머세트를 이용하여 3개의 새로운 LMW-GS i 타입 유전자를 분리하였고 이들의 분리된 유전자는 각 각 조경 II-2, CS III-5 그리고 금강 6-12로 명명하였다. 이들의 유추 아미노산을 분석한 결과 20개의 시그널 펩타이드, 이소루신으로 시작하는 N-말단 부분 그리고 글루타민이 많은 반복도메인 그리고 C-말단 부분으로 구성되어 있으며 조경 II-2와 CS III-5는 전형적인 LMW-GS i-type 유전자처럼 C-말단에 8개의 시스테인 잔기가 있었다. 금강 6-12는 특이하게도 하나 더 많은 9개의 시스테인 잔기가 존재하였는데 이 여분의 시스테인 잔기는7번째 시스테인 잔기의 11잔기 앞에 존재하며 TAT(타이로신)이 TGT(시스테인)로 바뀐 결과이다. LMW-i 타입 글루테닌 유전자들 간의 SNP와 InDel을 확인하기 위해서 본 연구에서 클로닝 된 조경 II-2, CS III-5 그리고 이전에 본 그룹에서 확인된 조경 HQ619933와 기존 문헌에 나와 있는 6배체 밀 유래의 10개의 LMW-GS i 타입 유전자들과 다중염기서열 분석을 실시하였고, 이들 사이에서 15개의 SNP와 1개의 insertion이 확인되었다. 밀 품종 조경의 Glu-A3 단백질을 동정하기 위해 글루테닌을 추출 이차원전기영동을 하고 Glu-A3c 위치의 스팟을 절취하여 in-gel digestion한 후 LC-ESI MS/MS 분석을 수행한 결과 조경의 i 타입 LMW-GS 유전자좌는 Glu-A3c로 확인되었다. LMW-i 타입 글루테닌 유전자들의 연관 관계를 분석하기 위해 본 연구 그룹에서 클로닝 한 조경 II-2, CS III-5, 금강 6-12 그리고 조경 Q6199333와 Genebank DB의 35개의 LMW-i 타입 글루테닌 유전자의 유추 아미노산 서열을 이용하여 Phylogenic tree를 완성하였다. 이들 39개의 계통도 분석 결과 이배체 밀과 4배체 밀의 LMW-i 타입 글루테닌이 육배체 밀의 LMW-i 타입 글루테닌과 크게 나눠지는 것을 확인하였으며, 육배체 밀의 LMW-i 타입 글루테닌들은 Glu-A3a부터 GluA-3g까지 7개 subgroup으로 나눠지는 것을 확인하였다. 금강 6-12는 GluA-3a와 GluA-3c 사이에 존재하였고 조경 II-2와 CS III-5는 GluA-3d와 일본 연질 밀인 농림 61의 AB062878과 같은 subgroup에 존재하였고 조경 HQ6199333은 Glu-A3c subgroup에 위치하였다. LMW-i 타입 글루테닌 유전자들의 유추 아미노산 다중서열분석결과 반복 도메인은 length polymorphism은 179～149개 정도의 long 타입과 91, 51, 10, 2개의 short 타입으로 나눠지고 이것은 long 타입과 short 타입 LMW-i 타입 글루테닌 유전자를 구분 할 수 있는 마커로 이용 가능하다.
To evaluate qualitative and quantitative expression level of HMW-GS protein, we separated glutenin fractions and conducted two-dimensional electrophoresis (2DE) in 32 Korean wheat cultivars. The average spot number of HMW-GS in Korean wheat cultivars was 11.78 which included 1.31, 5.53 and 4.94 spots at Glu-A1, Glu-B1 and Glu-D3 loci, respectively. Cultivars harboring 1, 2* subunits had more spots than ones with null allele in Glu-A1 locus because Glu-B1 and Glu-D3 loci did not show difference in spot number. A large variation in the total spot number of HMW-GS was observed ranging from 7 (Dahong) to 18 (Jokyung). Relative expression level of Korean wheat cultivars when compared with the check accession Chinese Spring ranged from 24% (Eunpa) to 111% (Gobun) with an average of 44%. Korean wheat accessions could be classified into six groups based on the number of HMW-GS spots and quantification value of each spot.
The high-molecular-weight glutenin subunit (HMW-GS) 1Dx2.2 from the Korean wheat cultivar ‘Uri’ was identified and characterized by one and two dimensional gel electrophoresis, and by liquid chromatography electrospray ionization-tandem mass spectrometry (LC-ESI MS/MS). The amplified coding region of this gene was also cloned and sequenced. Molecular characterization of the 1Dx2.2 gene revealed an open reading frame of 2919-bp encoding a polypeptide of 973 amino acids. In addition, the number of cysteines is four compared to that of a typical x-type HMW-GS which has four cysteines. A sequence comparison of the 1Dx2.2 allele in Uri with previously characterized 1Dx2.2 alleles revealed 8 single nucleotide polymorphisms, among which four SNPs were found to be non-synonymous. To confirm the authenticity of the 1Dx2.2, extracted glutenin proteins were separated by two dimensional gel electrophoresis and analyzed by mass spectrometry. Three spots were observed in the 1Dx2.2 position and were identified as HMW-GS 1Dx2.2 by LC-ESI MS/MS and a MASCOT database search. We successfully purified 1Dx2.2 to a single band by fast protein liquid chromatography (FPLC). This is first report on the molecular cloning and characterization of the HMW-GS 1Dx2.2 in a Korean wheat variety and purification of its protein product.
LMW-GSs represent approximately 1/3 of the total wheat gluten fraction. Even though they are important in the context of wheat end-use quality, they have not been widely studied. In this study, we report on the qualitative and quantitative analysis of LMW-GS in 32 Korean wheat cultivars by 2DE to provide basic information for wheat breeding. We firstly identified spots corresponding each of the Glu-3 alleles. The 2DE results for each cultivar will be used as reference map or protein marker discriminating among wheat cultivars, and imported and Korean flour. It is notable that five LMW-GS spots detected at a common position were hexaploid-specific. It remains to be clarified what function in glutenin biosynthesis these spots might play. The total spot number ranged between 20 and 10, and the average spot number was 17.12. The average number of spots in Glu-A3, Glu-B3 and Glu-D3 were 3.0, 4.56 and 2.96 respectively. Korean wheat cultivars were compared with the Chinese spring (1.0) in the average relative expression level, and the average was low as 0.67. Gobun was the highest as 1.32 and Baekjoong was the lowest as 0.24. Korean wheat could be classified into five groups based on the genetic distance using the frequency of HMW-GS spots and quantification value of each spot.
Low-molecular-weight glutenin subunit (LMW-GS) in common wheat is important for quality processing of bread and noodles. The objectives of this study were to clarify the composition of LMW-GSs and to identify their corresponding proteins. Using LMW-GS specific primers we cloned and characterized 43 LMW-GS genes in the wheat cultivar ‘Jokyoung’. Some of these genes contain polypeptides different in size due to the presence of various deletions or insertions within repetitive and glutamine-rich domains. The comparison of deduced amino acid sequence of the LMW-GS genes in Jokyoung with that of 12 groups LMW-GSs of wheat cultivar Norin 61 showed that the deduced amino acid sequences were nearly the same to LMW-GS groups of 1, 2, 3/4, 5, 7, 10 and 11. All LMW-GS genes contain eight cysteine residues, which are conserved among all of the typical LMW-GS sequences. The relative positions of cysteine residues are also conserved, except those of the first and seventh. Based on phylogenetic analysis, the 43 sequences with the same N-terminal and C-terminal amino acid sequences were clustered in the same group. To identify the proteins containing the corresponding amino acid sequences, we determined the N-terminal amino acid sequence of 7 spots of LMW-GSs of Jokyoung separated by two-dimensional gel electrophoresis (2DE). Of them, Glu-B3 (LMW-m and LMW-s) and Glu-D3 (LMW-m) were detected in two and three spots, respectively and the others were not clear. Collectively, we classified diverse LMW-GSs and identified their corresponding protein products. These results will be helpful in breeding programs for improvement of wheat flour quality.
Three low molecular weight (LMW) glutenin subunit genes were isolated from hexaploid wheat cultivars (Triticum aestivum. L) using LMW-GS specific primers and designated as Jokyung II-2, CS III-5 and Keumkang 6-12, respectively. All sequences were classified as LMW-i type genes based on the presence of an N-terminal isoleucine residue. All comprised of four regions, the signal peptide, N- and C- terminal domains, and a repetitive domain. Although they showed high similarity with other LMW-i type genes from hexaploid bread wheat, they also displayed unique features. Particularly, Keumkang 6-12 subunit contained an extra cysteine residue in the C-terminus except for eight conserved cysteines, which resulted from a single-nucleotide polymorphism (SNP) of the A?G transition, namely tyrosine-cysteine substitution at position 335 from the N-terminal end. In addition, a total of 15 SNPs and one insertions/deletions (InDels) were detected among Jokyung II-2, CS III-5 and Jokyung HQ6199333 and 10 other LMW-i genes. Two dimensional gel electrophoresis and LC-ESI MS/MS analysis revealed that LMW i-type glutenin subunit of the Jokyung is Glu-A3c. The phylogenic analysis showed that LMW i-type genes were divided roughly into diploid and hexaploid groups and the hexaploid were further classified into 7 subgroups (Glu-A3a~g). We also found length polymorphism in the repetitive domain showing 2~179 amino acid residues variation among the previously published LMW-I type glutenin subunits. The length polymorphism can be used as reliable genetic marker for use in marker-assisted breeding to select for specific alleles of the quality-determining locus in wheat breeding program.
목차
- CHAPTER ONE: General introduction 11. 밀 22. 빵 가공적성 (Bread-making quality) 32-1. 전분 32-2. 지질 42-3. 단백질 53. 밀 저장단백질 53-1. 글루텐 63-2. 알부민 그리고 글로불린 83-3. 글리아딘 94. 고분자 글루테닌 단백질 서브유닛 (HMW-GS) 124-1. HMW-GS 구조와 탄성 154-2. HMW-GS와 제빵적성 (bread wheat quality) 185. 저분자 글루테닌 단백질 서브유닛 (LMW-GS) 206. 글루텐 고분자 구조 227. 밀 반죽의 유동학적 특성에 미치는 요인들 258. 본 연구의 목적 27CHAPTER TWO: Two-dimensional electrophoresis of high molecular weight glutenin subunits in Korean wheat cultivars 29Abstract 30Introduction 31Materials and Methods 34Results and Discussion 40Summary (in Korean) 57CHAPTER THREE: Characterization of the HMW-GS 1Dx2.2 gene and its protein in Korean wheat cultivar Uri 58Abstract 59Introduction 60Materials and Methods 62Results and Discussion 67Summary (in Korean) 78CHAPTER FOUR: Two-dimensional electrophoresis of low molecular weight glutenin subunits in Korean wheat cultivars 79Abstract 80Introduction 81Materials and Methods 84Results and Discussion 89Summary (in Korean) 108CHAPTER FIVE: Cloning of LMW-GS genes and identification of their protein products in korean wheat cultivar Jokyung 109Abstract 110Introduction 112Materials and Methods 115Results and Discussion 120Summary (in Korean) 131CHAPTER SIX: Characterization of three i-type LMW-GS genes in Korean wheat cultivars 133Abstract 134Introduction 136Materials and Methods 139Results and Discussion 144Summary (in Korean) 162REFERENCES 164ABSTRACT (in Korean) 182
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