서양애기장대에서 Auxin과 선천성 면역반응에 의해 조절되는 Brassinosteroid의 신호전달 네트워크 :Brassinosteroid signaling network coordinated by auxin and innate immunity in arabidopsis thaliana

윤지현

자료유형: 학위논문

저자정보: 윤지현 (중앙대학교, 중앙대학교 대학원)

지도교수: 김성기

발행연도: 2014

저작권: 중앙대학교 논문은 저작권에 의해 보호받습니다.

이용수6

초록· 키워드

식물의 생장은 환경적인 신호와 식물 호르몬 간의 유기적인 상호작용을 통해 조절된다. Brassinosteroids (BRs)는 식물 유일의 스테로이드성 호르몬으로, 세포의 수와 크기 증대를 통해 생장을 촉진한다. BR의 항상성은 식물의 정상적인 생활사에 필수적이며 생합성과 대사 수준을 통해 유지된다. 특히 대사유전자는 식물 내 활성형 BR의 함량을 조절하는데 매우 중요함에도 불구하고 그 조절 메커니즘에 대해 보고된 바가 거의 없었다. 이에 BR 대사 유전자들 중 PHYB ACTIVATION TAGGED SUPPRESSOR-1 (BAS1)의 발현이 Auxin 신호전달경로에 의해 조절되는 메커니즘에 대한 연구를 수행하였다. 기존에 Auxin는 BR과 다양한 생리현상에 함께 관여하여 다수의 early response gene을 공유하므로 BR과 상호작용할 가능성이 높을 것으로 예상되었다. Semi q-PCR 및 q-PCR결과, BAS1의 발현은 BR에 의해 피드백조절될 뿐만 아니라 Auxin에 의해서도 조절됨이 확인되었다. GUS reporter gene system을 통해 BAS1 promoter의 활성이 leaf tip, root tip, LRP 등 Auxin의 함량이 높은 것으로 알려진 조직들에서 강하게 나타나는 것을 확인하였다. 이러한 BAS1의 조직특이적 발현 양상은 기존에 Auxin의 전사인자 ARF7와 유사하였는데, ARF7의 knockout 돌연변이인 arf7-1에서 BAS1의 발현은 야생형에 비해 증가되어 있었다. arf7-1에서는 유식물 상태에서는 주뿌리 및 곁뿌리의 성장이, 성체상태에서는 로제트 잎과 줄기의 성장이 전반적으로 야생형보다 억제된 것을 관찰할 수 있었으며, BR 내생함량 분석 결과, 활성형 BR인, CS의 함량이 야생형에 비해 크게 감소된 것이 확인되었다. 이 결과는 arf7-1내의 증가된 BAS1의 발현이 BR의 대사를 촉진시켜 실제 활성형 BR의 함량을 감소시켰다는 것을 보여주었다. 또한 ARF7에 의한 BAS1의 조절 메커니즘을 분자수준에서 이해하기 위해 EMSA를 수행한 결과, ARF7은 BAS1의 promoter에 직접적으로 결합하였으며, 기존에 BAS1의 발현을 증가시키는 것으로 알려진 BR 전사인자 BZR1이 promoter에 결합하는 활성은 ARF7에 의해 억제되는 것이 확인되었다. 또한 ARF7은 BZR1 단백질 간에는 강한 결합이 확인되어 ARF7이 직 · 간접적으로 BAS1의 발현을 억제하고 있다는 것을 확인할 수 있었다. 이로써 Auxin 신호전달경로에 의해 BR 대사 유전자의 발현이 조절되며 그로 인해 식물의 생장 양상 및 내생 BR의 함량이 변화되는 메커니즘이 존재한다는 것을 알 수 있었다.
식물의 생장 및 발달과 더불어 BR은 여러 생물학적, 비생물학적 스트레스에 대한 반응에도 관여하는 것으로 알려져 있다. 기존에 BR에 의한 BRI1 신호전달경로는 식물의 선천성 면역반응을 매개하는 Flagellin Sensing 2 (FLS2) 신호전달경로와 BRI1-Associated receptor Kinase 1 (BAK1) co-receptor를 공유하는 등 상호작용이 존재할 것으로 예상되었으나, BAK1 의 하위 단백질들에 의한 상호작용에 대한 분자적 메커니즘은 명확히 설명되지 않았다. 이에 본 연구에서는 BRI1 신호전달경로의 bri1 Suppressor 1 (BSU1) family를 핵심으로 하여 FLS2 신호전달경로와의 상관관계를 조사하였다. Flg22에 대한 반응성이 감소된 bsu-q를 통해 BSU1f가 FLS2 신호전달경로의 활성화에 양성조절자로 기능한다는 것을 알 수 있었다. Yeast two-hybrid, pull down assay, semi in vivo pull down, Co-IP 등은 BSU1f가 FLS2 신호전달경로의 RLCK, BIK1과 결합한다는 것을 보여주었으며, kinase assay를 통해 BIK1이 BSU1을 강하게 인산화 시킨다는 것을 확인하였다. BIK1은 FLS2 receptor뿐만 아니라, BRI1과도 결합하였고 BRI1에 의해 인산화되는 것을 in vitro에서 확인하였다. 이 결과는 BRI1 신호전달경로와 유사하게 FLS2 신호전달경로에 있어서도 BSU1f가 RLCK인 BIK1을 통해 활성화 된다는 것을 보여준다. 또한 semi in vivo에서 BIK1과 BSU1간의 결합은 flg22에 의해서는 강화되었고 BL에 의해서는 약화되었다. 이를 통해 FLS2 신호전달경로가 활성화 되었을 때 상대적으로 이용가능한 BSUf의 pool이 감소할 가능성을 확인할 수 있었다. BSU1은 FLS2 신호전달경로의 하위에서 활성화되는 MAPK 신호전달경로의 MAPKKK, MEKK1과도 결합하는 것이 yeast two-hybrid를 통해 확인되었다. 이로써 BSU1의 하위에서는 MAPK 신호전달경로가 활성화되어 면역반응이 증가할 가능성을 확인할 수 있었다. BRI1 신호전달경로의 음성조절자로 작용하는 BIN2의 gain-of function mutant, bin2-1과 과발현 식물체 BIN2ox는 SA신호전달경로에 의해 발현이 증가하는 PR1을 높은 수준으로 발현하는 것이 q-PCR을 통해 확인되었다. in vitro에서와 in vivo에서 모두 BIN2는 PR1의 발현을 매개하는 전사인자인 TGA4와 결합을 나타냈으며, kinase assay를 통해 BIN2에 의해 TGA4가 인산화되는 것이 확인되었다. 또한 EMSA를 수행하였을 때 BIN2에 의해 인산화된 TGA4는 promoter와의 결합율이 증가하는 것이 확인되어 BIN2가 PR1의 발현을 통해 방어기작에 관여하는 부가적인 경로의 존재가능성도 확인하였다.

Plant growth is correlativity controled by environmental signals and plant hormones. Brassinosteroids (BRs) are growth-promoting steroidal hormones which regulate cell division and elongation of plants. Despite the importance of BR in growth of plants, little is known about signals that initiate catabolism of BR in plants.
BR and Auxin are interact each other, causing overlapping physiological effects in plant growth. Microarray studies provided that most early Auxin response genes responded to BR, suggesting that both hormones reciprocally are controled in the mRNA level. To understand BR homeostasis regulated by Auxin, molecular mechanism of a BRs catabolic gene, BAS1 by Auxin signal transduction was examined in the study.
Expression of BAS1 is up-regulated by Auxin in dose- and time-dependent manner. pBAS1-GUS constructs were activated in tissues including leaf tip, root tip and lateral root primordium where high level of Auxin is contained. Promoter region of ARF7, a transcription factor for Auxin signal transduction, is known to be activated in lateral root primordium in which pBAS1-GUS construct is expressed. arf7 mutation enhanced expression of BAS1, leading reduction of response upon exogenous BR treatment. Compared to wild type, primary root growth and lateral root development were inhibited at seedling stage, and rosette leaf and stem growth were suppressed at adult plant of arf7 mutants. Endogenous content of BR was measured to significantly reduced in arf7 mutants compared to that of wild type plants. Electrophoretic mobility shift assay (EMSA) showed that ARF7 can control BAS1 expression by direct binding to AuxRE motifs in putative promoter region od BAS1. BZR1 binding to BAS1 promoter was inhibited by competition with ARF7. ARF7 showed strong interaction with BZR1 in yeast two-hybrid assay and in vitro pull down assay. These implicate that ARF7 inhibits the expression of BAS1 directly or indirectly through protein-protein interaction with BZR1. Taken together, ARF7 seems to regulate the BAS1 expression, which leads to maintenance of BR homeostasis in A. thaliana.
In addition to growth promoting effects, BR induce plant tolerance to a wide spectrum of biotic and abiotic stresses. Previously, BRI1 signal transduction pathway was expected to interact with FLS2 signal transduction pathway. BAK1 has been considered a candidate for mediating such a interaction, because it serves as a co-receptor for both pathways in ligand-dependent manner. However it is unknown how the downstream components are interactive each other after perception of ligands.
In this study, BSU1f were suggested to be an essential module for interaction of BRI1 and FLS2 signal transduction pathways. Quadruple loss-of-function mutant of BSU1f, bsu-q, showed reduced response to flg22. BSU1f interacted with BIK1 that function under FLS2 as a RLCK in yeast two hybrid and in vitro pull down, semi in vivo pull down and Co-immunoprecipitation assays. Among BSU1f, BSU1 was strongly phosphorylated by BIK1, suggesting that BIK1 acts as a specific substrate for BIK1 kinase. BIK1 was phosphorylated by not only FLS2 but also BRI1 receptor kinase in vitro. In semi in vivo pull down assay, flg22 treatment enhanced the interaction of BIK1 and BSU1, but BL treatment reduced the interaction. These result provide that interaction of BIK1 and BSU1 is regulated by BRI1 and FLS2 receptors in different manners. Under the downstream of BSU1f, MAPK signal transductaion pathway seemed to be activated. In yeast two hybrid assays, BSU1 is strongly interact with MEKK1 which is known to be activated under FLS2 in the presence of flg22. Negative regulator of BRI1 signal transduction pathway, BIN2 was predicted to be a positive regulator of PR1 expression. qPCR results in BIN2 gain of function mutants showed increase of PR1 expression level compared to WT. BIN2 interacted with TGA4, a transcription factor involved in PR1 expression and directly phosphorylated it, leading that the binding of TGA4 to promoter region of PR1 is enhanced.
Conclusively, when flg22 activates the FLS2 receptor, BIK1 makes more complexes with BSU1 than normal condition, and activates the BSU1 by phosphorylation. BSU1 is then activates MAPK signaling via interaction with MEKK1, resulting in turn-on of defense responses. On the other hand, BSU1 negatively controls BRI1 signaling via derepression of BIN2 which causes inhibition of BES1/ BZR1 mediated growth promotion. BIN2 also contributes to defense by acting as a positive regulator through interaction with TGA4.

제1장 종합서론 1
I. Brassinosteroids (BRs) 1
II. Brassinosteroid 생합성 5
III. Brassinosteroid의 신호전달경로 10
IV. 연구 목적 15
제2장 서양애기장대에서 Auxin 신호전달에 의한 Brassinosteroid의 함량조절 분자기전에 관한 연구 18
I. 서론 18
II. 재료 및 방법 22
1. 식물 재료 및 생장조건 22
2. RT-PCR을 통한 transcripts 분석 22
2-1. Total RNA 추출 22
2-2. Reverse-transcription (RT) 23
2-3. Semi quantitative-polymerase chain reaction (Semi q-PCR) 23
2-4. 전기영동 및 semi q-PCR 정량 분석 24
2-5. Quantitative-polymerase chain reaction (q-PCR) 24
3. pBAS1-GUS transgenic plant 제작 25
3-1. Putative BAS1 promoter construct 제작 25
3-2. Putative BAS1 promoter의 binary vector 내로의 도입 26
3-3. Agrobacterium transformation 26
3-4. Agrobacterium-mediated plant transformation 27
4. Whole-mount GUS staining 28
5. Phylogenetic analysis 28
6. Genomic DNA 추출 29
7. Genotyping of arf7-1, arf19-2 and arf7-1xarf19-1 30
8. 표현형 분석 30
8-1. 뿌리 및 하배축 생장 30
8-2. 곁뿌리 발달 양상 31
9. 내생 BRs 함량 분석 31
9-1. Solvent partitioning에 의한 BRs의 분리 31
9-2. Silica gel column을 이용한 정제 32
9-3. Sep-Pak C18 cartridge column을 이용한 정제 32
9-4. Reversed phase HPLC를 통한 정제 32
9-5. Derivatization 34
9-6. GC-SIM/MS 분석 34
10. In vitro DNA-protein binding assay 34
10-1. ARF7, BZR1의 MBP fusion construct 제작 34
10-2. MBP fusion 단백질의 발현 유도 및 정제 35
10-3. BAS1 promoter의 DNA probe 제작 36
10-4. Electrophoretic Mobility Shift Assay (EMSA) 37
11. In vitro pull down assay 38
11-1. Entry clone 제작 38
11-2. MBP, GST fusion construct 제작 39
11-3. MBP, GST fusion 단백질의 발현 유도 및 정제 40
11-4. In vitro pull down assay 40
11-4-1. Rebinding of MBP-ARF7 to Amylose resin 40
11-4-2. In vitro pull down assay 40
11-4-3. Western blot (WB) 41
12. Yeast two-hybrid (Y2H) 41
12-1. AD, BD fusion construct 제작 41
12-2. Yeast transformation 42
12-3. Yeast transformation 배지 제작 43
12-4. Yeast two-hybrid assay 44
III. 결과 45
1. BAS1의 발현 양상 분석 45
1-1. Target BR 대사 유전자 선별 45
1-2. Auxin과 BR처리에 의한 BAS1발현 변화 48
1-3. GUS reporter gene system을 통한 BAS1의 발현패턴 분석 51
1-4. 후보 Auxin Response Factor (ARF) 선별 57
1-5. arf7/ 19 돌연변이에서 BAS1의 발현 변화 61
1-6. BR과 Auxin에 의한 ARF7의 발현 변화 66
1-7. arf7/ 19 돌연변이에서 BRI1 신호전달경로 활성화 여부 조사 68
1-8. arf7/ 19 돌연변이에서 BL 처리에 따른 BAS1의 발현 유도양상 71
2. arf7/ 19 돌연변이의 표현형 분석 74
2-1.유식물 상태에서의 표현형 분석 74
2-1-1. 주뿌리의 생장변화 74
2-1-2. BL 처리시, 주뿌리 생장변화 78
2-1-3. 곁뿌리의 발달변화 80
2-1-4. BL 처리시, 곁뿌리의 발달변화 82
2-1-5. 하배축의 생장변화 84
2-2. 성체 상태에서 표현형 분석 86
2-3. 내생 BRs 함량분석 88
2-3-1. Castasterone (CS) 내생함량분석 91
2-3-2. Brassinolide (BL) 내생함량분석 93
3. ARF7에 의한 BAS1의 발현조절 기작 연구 95
3-1. ‘PLACE’ 를 이용한 BAS1 putative promoter cis-element 분석 95
3-2. ‘EMSA’를 통한 BAS1 promoter 내 AuxREs와 ARF7의 결합 탐색 97
3-3. ‘EMSA’를 통한 BAS1 promoter 내 E-boxs와 ARF7, BZR1의 결합 탐색 99
3-4. ‘EMSA’를 통한 ARF7에 의한 BAS1 promoter 내 AuxRE[d]와 BZR1간 결합 변화분석 101
4. ARF7과 BZR1 단백질의 상호결합탐색 103
4-1. ‘Yeast two-hybrid를 통한 ARF7과 BZR1의 상호결합 탐색 103
4-2. ‘In vitro pull down assay’를 통한 ARF7과 BZR1의 상호결합 탐색 106
IV. 고찰 108
제3장 서양애기장대에서 BRI1과 FLS2에 의해 매개되는 신호전달경로 간 분자적 상호결합에 관한 연구 115
I. 서론 115
II. 재료 및 방법 121
1. 식물 재료 및 생장조건 121
2. RT-PCR을 통한 transcripts 분석 121
3. Seedling growth inhibition assay. 122
4. Pst DC3000 bacterial growth assay 122
5. Protein extraction and western blot (WB) 123
6. Entry clone의 제작 124
7. In vitro pull down assay 125
7-1. MBP 및 GST fusion construct 제작 125
7-2. MBP 및 GST fusion 단백질의 발현유도 및 정제 126
7-3. In vitro Pull down assay 126
7-3-1. MBP-BSU1과 GST-BIK1의 상호결합 126
7-3-2. MBP-BRI1, FLS2-KD와 GST-BIK1, BIKL1의 상호결합 126
7-3-3. MBP-TGA4와 GST-BIN2의 상호결합 126
8. Yeast two-hybrid (Y2H) 127
8-1. AD, BD fusion construct 제작 127
8-2. Yeast transformation 127
8-3. Yeast transformation 배지 제작 127
8-4. Yeast two-hybrid 128
9. Co-immunoprecipitation (Co-IP) 128
9-1. YFP, MYC fusion construct 제작 128
9-2. Agrobacterium transformation 129
9-3. Tobacco leaf infiltration 129
9-4. Co-immunoprecipitation (Co-IP) 129
10. Semi in vivo pull down assay 130
10-1. BIK1-YFP와 BSU1f-MYC의 상호결합 131
10-2. Flg22와 BL처리에 따른 BIK1-YFP와 BSU1f-MYC의 상호결합 131
11. Site-directed mutagenesis 131
12. In vitro kinase assay 132
13. In vitro DNA-protein binding assay 133
14. Phylogenetic analysis 133
III. 결과 134
1. BRI1과 FLS2 신호전달경로 간 상호작용 분석 134
1-1. BL과 flg22 처리에 의한 PTI marker 유전자들의 발현양상 134
1-2. bsu-q에서 Flg22 처리에 따른 PTI marker 유전자들의 발현양상 136
1-3. bin2-1 돌연변이와 BIN2ox 과발현 식물체에서 flg22 처리에 따른 PTI marker 유전자들의 발현양상 140
1-4. Flg22 처리시, bzr1-1D-CFP 형질전환식물체에서 생육억제양상 144
1-5. bzr1-1D-CFP 형질전환식물체의 Pst DC3000에 대한 저항성여부 조사 146
1-6. Flg22 처리시, BR에 의한 BZR1 단백질의 활성변화 조사 148
2. BSU1f에 의해 매개되는 PTI 신호전달경로 활성화 메커니즘 분석 151
2-1. ‘In vitro pull down assay’를 통한 BIK1과 BSU1의 상호결합 탐색 151
2-2. ‘Yeast two-hybrid’를 통한 BIK1과 BSU1f의 상호결합 탐색 153
2-3. ‘Co-immunoprecipitation’ 을 통한 BIK1과 BSU1f의 상호결합 탐색 155
2-4. ‘Semi in vivo pull down assay’를 통한 BIK1과 BSU1f의 상호결합 탐색 157
2-5. ‘In vitro kinase assay’를 통한 BIK1에 의한 BSU1f의 인산화여부 조사 159
2-6. ‘Yeast two-hybrid’를 통한 BIK1 homologs 와 BSU1f의 상호결합 탐색 161
2-7. BIK1, BIKL1과 BRI1과의 상호결합 및 인산화여부 조사 166
2-8. Flg22와 BL처리시 BIK1과 BSU1f간 결합수준 변화 탐색 170
2-9.‘Yeast two-hybrid’를 통한 BSU1f와 MEKKf의 상호결합 탐색 174
3. BIN2에 의해 매개되는 ETI 신호전달경로 활성화 메커니즘 분석 178
3-1. bsu-q, bin2-1 mutant와 BIN2ox 식물체에서 Flg22 처리에 따른 PR1의 발현양상 178
3-2. ‘In vitro pull down assay’를 통한 BIN2과 TGA4의 상호결합 탐색 181
3-3. ‘Yeast two-hybrid’를 통한 BIN2와 TGA4의 상호결합 탐색 184
3-4.‘In vitro kinase assay’를 통한 BIN2에 의한 TGA4의 인산화여부 조사 185
3-5. ‘EMSA’를 통한 BIN2가 TGA4의 DNA 결합 친화력에 미치는 영향조사 186
IV. 고찰 189
참고문헌 198
국문초록 219
Abstract 222

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