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(충북대학교, 충북대학교 대학원)

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덱스트란은 glucan polymer로 주로 α-1,6결합으로 이루어져 있고 1,3-1,4-,1,2-와 같은 가지 결합도 가지고 있어 사람의 소화효소에 의해 분해 되지 않으며, 김치와 같은 발효 식품에서 Leuconostoc mesenteroides에 의해 생성된다. 이는 대장까지 도달하여 장내미생물에 의해 분해되어 장내 유익균의 증식에 도움을 주는 prebiotic후보 물질이다. 한국인은 덱스트란이 풍부한 김치를 통해 많이 섭취하는 것으로 예상되지만 어떤 균이 이용하는지 알려져 있지 않아 본 연구를 수행하게 되었다. 따라서 본 연구의 목적은 사람 장내 미생물 중 dextranase 를 생성하는 균을 분리하고 균과 효소의 특성을 확인하는 것이다. 이를 위해 건강한 성인의 대변 샘플을 희석하여 blue dextran이 포함된 배지에 도말하고 혐기적 조건에서 배양시켜 형성된 투명환으로 균을 분리하였다. 이들을 순수배양하여 genomic DNA를 분리한 다음 RAPD-PCR을 통해 동일 균은 동일그룹으로 묶고 16S rRNA 서열분석을 통해 동정하였다. 덱스트란이 포함된 배지에 배양하여 얻은 상등액의 가수분해 산물 패턴을TLC를 이용하여 분석하였고 생성된 단쇄지방산(SCFA)의 종류와 양을 HPLC를 이용하여 분석하였다. Zymogram과 SDS-PAGE를 통해 dextranase activity와 분자량을 확인하였다. Dextranase genes은 specific primer를 통해 PCR 하여 증폭하였고 전체 서열을 분석하였다. 이중 특정 유전자는 클로닝 및 발현시킨다음 효소를 정제하고 활성을 측정하였다.
그 결과, 총 100여개의 균주가 대변으로부터 선택배지를 통해 분리되었고 이를 16S rRNA 유전자 서열분석으로 동정한 결과 다음과 같이 박테로이데스 속이 많이 존재 하였다. Bacteroides thetaiotaomicron (46 균주), B. ovatus (43 균주), B. vulgatus (1 균주), B. dorei (2 균주), B. xylanisolvens (2 균주), B. uniformis (1 균주) and Veillonella rogosae (6 균주). 각 그룹 별로 한 균주씩을 각각 선택하여 미생물 및 효소특성을 확인하였다. 먼저, 균주별로 덱스트란 가수분해 패턴을 확인한 결과, 모두endo-type 활성을 가지고 있었으며, SCFA 중 butyrate를 모든 균이 생성하였다. Dextranase 활성은 모두 membrane bound 조효소액에서 측정되어 세포에 부착된 효소임을 알 수 있었고 이들의 분자량은 50 kDa 또는 70 kDa 이었다. 이미 알려진 미생물의 유전서열을 이용하여 비교한 결과, 공통적으로 존재하는 ‘보존서열(conserved sequence)’이 있었고 이를 기반으로 합성한 프라이머를 이용하여 각각의 유전자를 증폭하였다. 유전자 서열분석과 계통수 비료과정에서 분리된 유전자들은 모두 GH 66으로 분류되었다. Bxdex 유전자는 1.8 kb이고 592 개 아미노산을 번역하며 유도성 플라스미드 pETDuet에 클로닝하고 E. coli BL21(DE3) star 균주에서 발현시켰다. 니켈 친화성 크로마토그래피를 이용하여 정제된 효소의 활성은 8,212.14 U/mg이었다. 분리 균주와 효소는 dextranoligosaccharides를 효율적으로 생성하는 방법에 이용 될 수 있을 것으로 기대된다.
#dextranase #intestinal bacteria #dextranoligosaccharides

목차

  1. Chapter I. Literature Review and Research Objectives 12
    1.1 Dextran 13
    1.2 Dextran fermentation by gut bacteria 15
    1.2.1 Dextranoligosaccharides 15
    1.2.2 Short-chain fatty acids 16
    1.3 Dextranase 19
    1.3.1 Classification of dextranase 19
    1.3.2 Dextranase from bacteria 20
    1.3.3 Sequence comparison studies 22
    1.3.4 Secondary and tertiary structures of dextranases 25
    1.4 Carbohydrate metabolism in the human intestinal bacteria 28
    1.5 Dextran in foods 30
    1.6 Research objectives 32
    Chapter II. Isolation and Characterization of Dextran-hydrolyzing Bacteria from Human Intestine 34
    2.1 Introduction 35
    2.2 Materials and methods 37
    2.2.1 Media and enumeration procedures 37
    2.2.2 Isolation of dextranolytic bacteria 39
    2.2.3 Preparation of genomic DNA 39
    2.2.4 RAPD-PCR analysis 40
    2.2.5 Sequencing of 16S rRNA gene 41
    2.2.6 Measurement of dextran concentration 41
    2.2.7 TLC analysis of dextranolytic products 42
    2.2.8 HPLC analysis of short chain fatty acids 43
    2.2.9 Preparation of crude enzyme 43
    2.2.10 Zymogram and SDS-PAGE analysis 44
    2.3 Results 46
    2.3.1 Enumeration of dextranolytic strains 46
    2.3.2 RAPD profiles 48
    2.3.3 Identification of grouped isolates 50
    2.3.4 Growth of B. xylanisolvens in dextran-medium 54
    2.3.5 Hydrolysis products of B. xylanisolvens in media with dextran 56
    2.3.6 Dextran hydrolysis pattern by isolates 58
    2.3.7 Short-chain fatty acid (SCFA) analysis 60
    2.3.8 Subcellular localization of the dextranolytic enzymes 62
    2.3.9 Determination of molecular weights of dextranases elaborated from isola from isolates 64
    2.3.10 Discussion 66
    2.4 Conclusion 68
    Chapter III. Cloning and Expression of Dextranase Genes, and Purification and Activity Assay of the Enzyme 70
    3.1 Introduction 71
    3.2 Materials and methods 73
    3.2.1 Bacterial strains, plasmids, and selection media 73
    3.2.2 Oligonucleotides and reagents 75
    3.2.3 Amplification of dextranase gene 77
    3.2.4 Isolation and purification of DNA fragments 78
    3.2.5 Construction of recombinant plasmid 79
    3.2.6 Transformation of Escherichia coli 79
    3.2.7 Preparation of plasmid DNA 80
    3.2.8 DNA sequencing 81
    3.2.9 Expression of the Bxdex gene 81
    3.2.10 Purification of recombinant enzymes using a Ni-NTA column 82
    3.2.11 SDS-PAGE analysis 83
    3.2.12 Determination of protein concentration 84
    3.2.13 Assay of enzyme activity 84
    3.3 Results 86
    3.3.1 Primer sequences for amplication of dextranse genes 86
    3.3.2 Amplification of dextranase gene using the PCR 87
    3.3.3 Comparative amino acid sequence analysis of dextranase genes 89
    3.3.4 Construction of recombinant plasmid pETBxdex 92
    3.3.5 Expression of the Bxdex enzyme in E. coli 94
    3.3.6 Purification of Bxdex enzyme 96
    3.3.7 Analysis of the reaction product 98
    3.3.8 Discussion 100
    3.4 Conclusion 102
    REFERENCES 103
    SUMMARY IN KOREAN 110

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