냉이로부터의 포자형성세균 분리 및 특성 규명 : Isolation and Characterization of spore forming bacilli (SFB) from Shepherd’s purse (Capsella bursa-pastoris) :

이원준

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자료유형: 학위논문

저자정보: 이원준 (중앙대학교, 중앙대학교 대학원)

지도교수: 김근성

발행연도: 2015

저작권: 중앙대학교 논문은 저작권에 의해 보호받습니다.

이용수1

초록· 키워드

본 연구에서는 경기도 안성시에서 확보한 세척하지 않은 냉이로부터 총 28개의 포자형성세균을 분리하였다. 총 28개 중 25개 분리균주를 선택하여 동정한 후, 식품 안전 및 부패와 관련된 실험을 진행하였다. 분리균주의 동정에는 PCR방법이 이용되었다. PCR을 이용하여 16S rRNA gene의 단편조각 (93.0%)을 증폭하였으며, PCR amplicon 염기서열의 양 방향을 모두 분석하여 분리균주의 염기서열을 결정하였다. GenBank 데이터 베이스를 이용하여 Blast 검색을 수행한 결과, 25개의 분리균주가 Bacillus species (9종), Paenibacillus species (3종) 그리고 Brevibacillus species (1종)로 동정되었다. Bacillus cereus에서 주로 검출되는 독소 유전자인 Hemolysin BL (HBL) genes (hblA, hblC, 및 hblD)와 non-hemolytic enterotoxin (NHE) genes (nheA, nheB, 및 nheC) 그리고 emetic toxin gene (ces)의 보유 여부를 확인한 결과, B. pseudomycoides로 동정된 2개 냉이 분리균주 (NA-16, NA-17)에서 Hemolysin BL (HBL) complex를 코딩하는 3개 유전자 (hblA, hblC, 및 hblD)가 모두 검출되었다. 나머지 NHE gene과 emetic toxin gene은 25개 냉이 분리균주에서 모두 검출되지 않았다. 총 25개 분리균주의 항생제 내성을 측정한 결과, 총 19개 Bacillus분리균주 중 3개 분리균주 (15.79%)가 clindamycin에 대하여 내성을 나타내었고, 총 4개 Paenibacillus 분리균주가 모두 (100%) oxacillin에 대하여 내성을 나타내었다. 또한 총 2개 Brevibacillus 분리균주가 모두 (100%) penicillin과 oxacillin에 대하여 내성을 나타내었다. 총 25개 분리균주의 부패 관련 효소 활성을 측정한 결과, 총 19개 Bacillus 분리균주 중 12개 분리균주 (63.16%)가 esterase에 대하여 강한 효소활성을 나타내었고, 총 4개 Paenibacillus 분리균주가 모두 (100%) β-galactosidase에 대하여 강한 효소활성을 나타내었다. 또한 총 2개 Brevibacillus 분리균주가 모두 (100%) α-chymotrypsin과 leucine arylamidase에 대하여 강한 효소활성을 나타내었다. 결론적으로, 냉이로부터 분리한 포자형성세균의 미생물학적 프로파일은 식품 관련 기관 및 산업체, 그리고 학계 등의 종사자들에게 참고자료로 활용될 수 있을 것으로 사료된다.

Shepherd’s purse (Capsella bursa-pastoris) native to Europe is an edible wild plant and it has been naturalized in many parts of the world including Korea. From two unwashed Shepherd’s purse samples, 28 SFB isolates were isolated and 25 were selected based on their colony morphologies. The partial fragments (93.0%) of their 16S rRNA genes were amplified by PCR reactions. The consensus sequences of the PCR amplicons were determined by bidirectional sequencing. Using its 16S rRNA gene sequence, the identity of each SFB isolate was determined by searching the GenBank database through the BLAST search engine. Diverse Bacillus species (9 species), Paenibacillus species (3 species) and Brevibacillus species (1 species) were isolated from Shepherd’s purse. All the 25 SFB isolates obtained from Shepherd’s purse were screened to detect three haemolysin BL (HBL) complex genes (hblA, hblC, and hblD), three non-haemolysin enterotoxin (NHE) complex genes (nheA, nheB, and nheC), and one emetic toxin gene (ces), originally detected in the species Bacillus cereus. All the three genes for the HBL enterotoxin complex were detected in two B. pseudomycoides isolates, but other genes were not detected in any SFB isolates. The partial sequences of hblA, hblC, and hblD genes for the two SFB isolates were identical and compared with the counterpart sequences of reference strain Bacillus cereus ATCC 14579. The partial hblA gene fragment (822 bp) contains 40 (4.87%) non-synonymous and 48 (5.84%) synonymous substitutions, resulting in 28 (10.22%) amino acid substitutions. The partial hblC gene fragment (747 bp) contains 56 (7.50%) non-synonymous and 46 (6.16%) synonymous substitutions, resulting in 43 (17.27%) amino acid substitutions. The partial hblD gene fragment (890 bp) contains 65 (7.30%) non-synonymous and 56 (6.29%) synonymous substitutions, resulting in 46 (15.49%) amino acid substitutions. Antibiotic resistance of all the 25 SFB isolates were assessed for ampicillin, penicillin, oxacillin, tetracycline, erythromycine, chloloramphenicol, gentamicin, and clindamycin by using the disk diffusion method. Among the 19 Bacillus isolates, 3 SFB isolates (15.79%) were resistant against clindamycin. All the 4 Paenibacillus isolates (100%) were resistant against oxacillin. All the 2 Brevibacillus isolates (100%) were resistant against both penicillin and oxacillin. Spoilage potentials of all the 25 SFB isolates were assessed by measuring the activities of spoilage-related enzymes. Among the 19 Bacillus isolates, 12 SFB isolates (63.16%) have strong activity of esterase. All the 4 Paenibacillus isolates (100%) have strong activity of β-galactosidase. All the 2 Brevibacillus isolates (100%) have strong activity of both α-chymotrypsin and leucine arylamidase. In conclusion, the findings of this study on profiles of SFB from Shepherd’s purse and their toxigenic and spoilage-related characteristics are hoped to provide an integrated information to the related food research and industrial sectors.

1. Introduction 1
2. Materials and methods 5
2.1 Isolation of SFB from Shepherds purse 5
2.2 Identification of SFB isolates 6
2.3 PCR detection and sequence analysis of genes for enterotoxins and emetic toxins 8
2.4 Antibiotic resistance testing 10
2.5 Spoilage potential of SFB isolates 12
3. Results and Discussion 13
3.1 Isolation of SFB from Shepherds purse 13
3.2 Identification of SFB isolates 13
3.3 PCR detection and sequence analysis of genes for enterotoxins and emetic toxins 19
3.4 Antibiotic resistance testing 25
3.5 Spoilage potential of SFB isolates 29
4. Discussion 33
5. References 37
국문초록 50

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