Production and characterization of monoclonal antibodies to CD4+ cells of olive flounder(Paralichthys olivaceus) : 넙치 CD4+T cell 에 대한 단일클론항체 생성과 특징에 대한 연구 :

Eun young Ha

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자료유형: 학위논문

저자정보: Eun young Ha (한동대학교, 한동대학교 일반대학원)

지도교수: Byung Sun Suh

발행연도: 2015

저작권: 한동대학교 논문은 저작권에 의해 보호받습니다.

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초록· 키워드

포유동물에서 T 세포는 림프구의 형태로 세포매개성면역에 중요한 역할을 한다. T 세포는 T 세포표면에 있는 수용체의 형태로 B 세포와 자연살해세포와 같은 다른 림프구와 구분할 수 있다. T 세포는 보조 T 세포와 세포독성 T 세포와 같은 부분으로 나뉜다. CD4 당단백질은 55kKa 의 단량체 형태이며, 4 개의 Immunoglobulin-like extracellular domain 을 가지고 있다. 또한 CD4 당단백질은 TCR 의 co-receptor 로써 항원을 인식하는데 관여한다. Naive CD4+ T 세포들은 적어도 5 종류의 effector T 세포들로 분화가 된다. 이런 CD4+ T 세포들은 면역 조절, 면역기전, 숙주방어와 같은 역할에서 아주 중요한 부분을 차지한다. CD$+ T 세포들은 이질성에 따르는 가소성에 의해 특징이 지어진다. 우리는 어류에서 T cell 을 분석하는 것이 포유동물의 면역체계와 유사한 시스템을 가진 가장 원시적 척추동물이라고 본다. 이것은 포유동물과의 네트워크와 CD$+ T 세포의 다양성을 이해하는데 효과적인 접근을 제공해줄 수 있다. 경골어류에서 CD4 는 4 개의 Ig-like extracellular domain 을 가지는데 이를 CD4-1이라고 명명한다. 또한 경골어류는 Ig-like domain 을 2개 또는 3개를 가지는 CD4-2를 가지고 있다. CD4-1 와 CD4-2는 p56lck 티로신 카이네이즈 모티프(tyrosine kinase motif)를 가지고 있고 흉선에서 mRNA가 우세하게 발현되었다. 그렇지만 경골어류 림프구에서 CD4-1과 CD4-2의 분포와 그 역할은 아직 불분명하다. 넙치는 동남아시아에서 많이 분포되어있는 어류이다. 또한 한국, 중국, 일본에서는 넙치양식이 성공적으로 이루어지고 있다. 경골어류 에서 CD4 homologues 가 발표되었지만 T cell 자체에 대한 연구는 잘 되어 있지 않는 사정이다. 단일클론항체와 같은 reagent 의 부족으로 어류 T 세포의 분류는 모호한 상태이다. 비록 최근에 어류에서의 T 세포에 특이적인 세포표면표지자(cell surface markers)의 식별과 특징에 대한 연구가 급속하게 증가하고 있찌만, 이 표지자들에 대한 항체는 거의 없는 실정이다. 넙치의 T 세포를 연구하기 위해서, 본 연구에서 넙치의 CD4-1 와 CD4-1 단일클론항체를 생산했다. 이 단일클론항체들은 SDS-PAGE(Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis)에서 중연쇄(Heavy chain)와 경쇄(Light chain)으로 구분이 되었고, 그 크기는 각각 약 70kDa 과 30kDa이다. 유력한 융합세포클론들은 한계희석법과 효소면역측정법(ELISA)를 통해서 확인 되었다. 3 개의 단일클론 항체 중에서 한 개의 클론이 특수 단백질 검출 검사(Western blot)에서 CD4 재조합 단백질을 인지 할 수 있었다.
이 연구를 통해, 넙치에서 처음으로 CD4-1, CD4-2와 같은 CD4+ T 세포에 대한 단일클론 항체가 만들어진 것을 확인하였다. 이것이 앞으로 넙치에서 CD4+ T cell 분리를 가능하게 하고 어류의 면역체계를 이해하는데 도움을 줄 것으로 이해된다.

In mammals, T cell is a type of lymphocyte that plays a central role in cell-mediated immunity. They can be distinguished from other lymphocytes, such as B cells and natural killer cells, by the presence of a T cell receptor on the cell surface. They divided into some subsets such as helper T(Th) lymphocytes and cytotoxic T lymphocytes(CTLs).
Naive CD4+ T cells differentiate into at least five types of effector T cell (Th1, Th2, Th17, Th9 and Th22), several subsets of regulatory T cells and memory T cells. These CD4 + T cells play essential roles in immune regulation, immune pathogenesis and host defense. CD4+ T cells are characterized by thier plasticity in addition to heterogeneity. We believe that analysis of Tcell subsets in fish, the most primitive vertebrates possessing an immune system homologous to that of mammals, can provide an effective approach to understanding the presence of CD4+ T cell diversity and networks in mammals. CD4 glycoprotein is a 55kDa monomer expressed on the surface of Th cells and contains four immunoglobulin-like extracellular domains. Also CD4 glycoprotein participates in antigen recognition as co-receptor of TCRs. In teleost fish, a CD4 homologue containing for Ig-like extracellular domains, designated as CD4-1. Telelost fish have a second CD4 homologue, designated CD4-2, that contains two or three Ig-like domains. Both CD4-1 and CD4-2 possess a p56lck tyrosine kinase motif in their cytoplasmic tail and their mRNAs are expressed predominantly in the thymus. However, the distribution of CD4-1 and CD4-2 in the teleost lymphocytes and the roles of CD4-1 and CD4-2 positive cells are unclear.
Olive flounder is widely distributed in Northeast Asia. Also Olive flounder is successfully cultured in aquaculture in Korea, China and Japan. In teleost fish, T cell is not well studied, although CD4 homologues have been reported. Certain Claasification of fish T cells has been ambiguous by the lack of reagent, such as monoclonal antibodies, for use as tools to recognize T cell by their related proteins. Although in recent years th identification and characterization of cell- surface markers specific to T cells has rapidly increased i elelost, there are few antibodies against these markers. To recognize T cells we produced CD4-1 and CD4-2 monoclonal antibodies(mAbs). These antibodies were purified and consisted of heavy chains and light chains approximately 70 and30kDa in PAGE gel. Hybridoma clones were initially identified by limiting dilution and ELISA. Anibg the three mAbs, only one clone was able to detect a 49kDa recombinant protein in western blot. To our knowledge, this is the first report of anti-CD4-2 monoclonal antibodies from olive flounder, Paralichthys olivaceus. These results suggest that it can be beneficial in the characterization of the teleost fish immune system.

Abstract Ⅰ
국문초록 Ⅲ
List of Figures Ⅵ
List of Tables Ⅶ
Ⅰ. Introduction 1
Ⅱ. Materials and Methods 3
2.1 CD4-1, CD4-2 recombinant protein preparation 3
2.2 Production of monoclonal antibody 3
2.3 Hybridoma screening 3
2.4 Purification of CD4-1 and CD4-2 mAb 4
2.5 BCA assay and antibody concentration 4
2.6 SDS PAGE and Western blot analysis 4
Ⅲ. Results 6
3.1 Production of anti CD4-1 and CD4-2 monoclonal antibodies 6
3.2 BCA assay result of purified monoclonal antibody 10
3.3 Screening of anti CD4-1 and CD4-2 monoclonal antibodies 12
3.4 The confirmation of antibody specificity using Western blotting 15
3.5 The confirmation of antibody specificity using tissue Western blotting 17
Ⅳ. Discussion 19
Ⅴ. References 21
Acknowledgements 24

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