Identification of Differentially Expressed Genes during Cymbidium mosaic virus Infection in Chenopodium amaranticolor :심비디움 모자이크 바이러스 감염 시 명아주에서 특이적으로 발현되는 유전자 검정

김수민

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자료유형: 학위논문

저자정보: 김수민 (서울여자대학교, 서울여자대학교 일반대학원)

지도교수: 최선희, 류기현

발행연도: 2016

저작권: 서울여자대학교 논문은 저작권에 의해 보호받습니다.

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초록· 키워드

Cymbidium mosaic virus (CymMV)에 감염된 Dendrobium nobile의 잎을 갈아 Chenopodium amaranticolor (C. amaranticolor)에 접종하였을 때, C. amaranticolor는 전신 감염이 되지 않고, 접종엽에 local lesion이 나타났다. 이 local lesion에 대한 관련 유전자 탐색을 위해 본 연구에서는 CymMV를 접종한 C. amaranticolor 잎에서 감염 초기의 관련 유전자 탐색을 위해 1, 4 dpi, 후기의 관련 유전자 탐색을 위해 7, 11 dpi에 해당하는mRNA를 분리하였고, 같은 dpi에 해당하는 mock 감염 C. amaranticolor의 잎에서도 mRNA를 분리하여 subtractive hybridization을 진행하였다. 그 결과, 총 245개의 클론으로부터lipoxygenase, cold- and drought- regulated protein, jasmonate induced protein, lupeol synthase, heat shock protein같은 방어 및 스트레스 관련 유전자를 포함한 66개의 EST들이 밝혀졌으며, 이를 기능별로 분류하였을 때 광합성에 관련된 EST들이 27%, 방어 및 스트레스 관련 EST들이 21%를 차지했다. 이 중 방어 및 스트레스에 관련된 EST들 중 lipoxygenase, jasmonate induced protein, cold- and drought- regulated protein, senescence-associated protein, ADP-ribosylation factor, glucan endo-1,3-β glucosidase의 CymMV 감염체 및 mock 접종엽에서의 발현 수준 비교를 위해 semi-quantitative RT-PCR을 하였다. 그 결과, lipoxygenase는 CymMV 접종 4일째에 해당하는 C. amaranticolor의 접종엽에서 가장 발현량이 높았으며, jasmonate induced protein은 1, 4dpi mock, cold- and drought- regulated protein은 1, 4dpi CymMV 감염체에서 발현량이 높은 것으로 추정되었다. 한편, senescence-associated protein은 CymMV 접종 4일째에 해당하는 C. amaranticolor의 접종엽에서 mock에 비해 발현량이 약간 높은 것으로 확인되었다. ADP-ribosylation factor는 CymMV 접종 1, 4일째에, mock에서는 7, 11일째에 발현량이 높았고, glucan endo-1,3-β glucosidase는 4, 7, 11 dpi의 mock에서 발현량이 비교적 적은 것으로 확인되었다. C. amaranticolor에 나타나는 CymMV의 병징은 저항성 유전자의 발현이 확인되지 않고, 괴사가 느리게 진행되는 것으로 보아 전형적인 HR과는 다르나, lipoxygenase, jasmonate induced protein 등의 발현 양상으로 보아 다른 저항성 기작이 있는 것으로 보인다.

Cymbidium mosaic virus (CymMV) acquired by grinding a CymMV-infected Dendrobium nobile (D. nobile) leaf was mechanically inoculated onto Chenopodium amaranticolor (C. amaranticolor) and local lesion symptoms were observed in the inoculated leaf. For the detection of genes activated soon after CymMV infection, inoculated leaves were collected at 1 and 4 days post inoculation (dpi). Leaves also were collected at 7 and 11 dpi to identify genes later after infection. Then, mRNA isolation and subtractive hybridization were performed to identify genes related to the local lesion response to CymMV in C. amaranticolor. In total, 66 expressed sequence tags (ESTs) including genes related to defense and stress such as lipoxygenase, jasmonate induced protein, lupeol synthase and heat shock protein were identified from 245 clones. According to their functional categories, a large proportion (27%) of the ESTs were involved in photosynthesis, followed by defense/stress (21%). Expression levels of genes encoding lipoxygenase, senescence associated protein, jasmonate induced protein, cold- and drought-regulated protein, ADP-ribosylation factor, and glucan endo-1,3-β glucosidase were determined by semi-quantitative RT-PCR. As a results, lipoxygenase was up-regulated at 4 dpi in a CymMV-infected leaf and a jasmonate induced protein was up-regulated at 1 and 4 dpi in a mock-infected leaf. In addition, a cold- and drought-regulated protein was up-regulated at 1 and 4 dpi after virus infection. Although the genes for senescence-associated protein also were detected by subtractive hybridization, but no significant up- or down-regulation was observed by semi-quantitative RT-PCR at 1, 7, and 11 dpi. At 4 dpi, in the CymMV inoculated leaf, PCR results showed slightly greater amplification than in the mock from the same dpi. ADP-ribosylation factor was up-regulated at 1 and 4 dpi after virus infection and glucan endo-1,3-β glucosidase was down-regulated at 4, 7 and 11 dpi in the mock. Symptoms of CymMV infection on C. amaranticolor were quite different from a typical HR, considering the failure of resistant gene expression before and after the infection and the slow progression of necrosis. However, the expression pattern of genes including lipoxygenase and jasmonate induced protein suggest the presence of different types of resistance mechanisms.

#Cymbidium mosaic virus #Chenopodium amaranticolor #Differentially Expressed Genes #Subtractive hybridization

TABLE OF CONTENTS
LIST OF ABBREVIATIONS
LIST OF FIGURES AND TABLES
ABSTRACT
I. INTRODUCTION
II. MATERIALS AND METHODS
1. Plant and virus materials
1.1. Plant materials
1.2. Virus source
1.2.1 Sample collection and total RNA extraction from D. nobile
1.2.2. RT-PCR for detection of CymMV CP
1.2.3. Cloning and sequence analysis of CymMV CP
1.3. Virus inoculation onto C. amaranticolor
1.4. Preparation of experimental samples
2. mRNA isolation from C. amaranticolor
3. Subtractive hybridization
3.1. cDNA synthesis
3.2. Rsa I digestion
3.3. Adaptor ligation
3.4. Hybridization
3.5. PCR
4. Cloning and sequence analysis of cDNA clones obtained from subtractive hybridization
5. Semi-quantitative RT-PCR for comparing mRNA expression level
5.1. Total RNA extraction from C. amaranticolor
5.2. Primers for semi-quantitative RT-PCR
5.3. RT-PCR
III. RESULTS
1. Detection of CymMV in D. nobile as the virus source
2. Symptoms observation in C. amaranticolor and CymMV detection using RT-PCR to verify infection
3. Construction of differentially expressed cDNA library by subtractive hybridization
4. Profiling of differentially expressed genes of CymMV infection in C. amaranticolor according to their functional category
5. Expression level of differentially expressed genes using semi-quantitative RT-PCR
IV. DISCUSSION
V. REFERENCES
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