Metabolic Profiling of Serum and Cells for Identifying Potential Biomarkers and Pathways : Applications to Kidney, Cardiovascular and Cancer Diseases :

이주은

자료유형: 학위논문

저자정보: 이주은 (성균관대학교, 성균관대학교 일반대학원)

지도교수: 류도현, 황금숙

발행연도: 2016

저작권: 성균관대학교 논문은 저작권에 의해 보호받습니다.

이용수1

초록· 키워드

질환의 진단, 예측 및 모니터링에 대한 관심의 증가와 최근의 “오믹스”기술을 이용한 연구의 발전과 함께, 대사체학을 이용한 질환 연구에 대한 가능성이 대두되고 있다. 대사체 바이오마커 발굴을 통해 조기 진단의 가능성을 제시하고, 대사체 프로파일을 이용한 질환의 단계 및 예후 예측이 가능 할 뿐만 아니라, 치료에 대한 반응을 모니터링 하거나 질환의 메커니즘을 규명 하기 위한 유용성이 입증되고 있다. 대사체는 식이, 환경, 유전 등과 같은 다양한 요인에 따라 변화를 보이며, 세포 기전의 마지막 단계로 가장 표현형에 가깝다. 또한 다른 “오믹스” 기법과 비교해 볼 때, 대사체의 변화가 가장 큰 폭으로 변하는 장점이 있기 때문에 대사체학을 이용한 질환의 연구는 그 유용성이 큰 것으로 알려져 있다. 따라서, 본 박사학위 과정 동안, 다양한 질환 연구를 위한 대사체학의 유용성을 확인하고자 하였으며 신장질환, 심혈관계질환, 암 질환에 적용하여 대사체 바이오마커 발굴 및 질환 관련 메커니즘을 규명하고자 하였다.
먼저, NMR을 기반으로 하여 당뇨성 만성 신부전환자와 비당뇨성 만성 신부전 환자의 혈청 대사체를 프로파일링 하였다. 다변량 분석기법을 통해 만성 신부전 환자의 단계별 대사체 차이를 확인 하였으며 당뇨와 비당뇨성 환자로 구분이 가능함을 확인 하였다. 고혈당증, 아미노산 대사이상, 요독증물질의 축적, 이상지질혈증과 같은 대사의 변화가 신부전 환자의 임상적 특징과 연관성이 있었다. 흥미롭게도, 당뇨는 초기 신부전 환자에서 가장 큰 대사체 차이를 보임을 확인 하였다. 또한, 혈청 대사체 프로파일을 이용하여 신부전 환자의 신장기능 및 단계를 예측할 수 있는 모델을 구축 하였으며 그 유용성을 확인 하였다.
대표적인 심혈관계 질환인, 심근경색에 대한 예후 및 치료 효과 등이 성별에 따른 차이가 있음이 연구되고 있으나 대사체 차이에 대한 연구는 아직 없다. 따라서, 본 연구에서는 LC-MS와 다양한 통계 기법을 이용하여 심근경색 질환과 심근경색의 진행에 기인하는 성별에 따른 대사체 차이를 확인 하고자 하였다. 다변량 통계 분석을 통해 심근경색 환자와 정상군 및 심근경색 환자에서의 성별에 따른 차이가 있음을 확인 할 수 있었다. 정상군과 비교하여 심근경색 환자에서 아미노산, 퓨린, 아실카니틴 등이 큰 차이를 보이고 있었다. 또한, 퓨린과 아실카니틴 대사는 심근경색 환자의 성별에 따른 변화를 보여 주었다. 이를 통해, 심근경색 환자의 혈청 대사체 변화 확인을 위한 질량분석 기반 대사체 프로파일링 기법의 유용성을 제시 하였다. 또한 성별에 따른 대사체 차이에 근거하여 심근경색 질환의 진단 및 치료에 적용이 필요함을 확인 하였다.
암환자의 궁극적인 사망 원인이 다양한 치료 후에 지속적으로 발생하는 재발, 전이에 의한 것으로 알려져 있다. 따라서 재발 및 전이를 조절하는 세포학적 기전 규명이 필요하다. 암세포는 당과 같은 영양소가 부족한 상황에서 대사 스트레스를 이겨내고 생존 및 전이를 위한 세포학적 기전이 존재할 것이라 제시 되고 있다. 이에 본 연구에서는, NMR과 MS를 이용한 대사체학 연구를 통해 대사 스트레스에 대항하는 암세포의 생존 및 전이를 위한 기전을 규명하고자 하였다. 첫 번째로, 대사체와 전사체의 통합 프로파일링을 통해 Wnt pathway 조절이 Ca2+ 기전을 조절하여 암세포의 생존 및 전이에 유리한 환경을 제공함을 확인 하였으며, NAAD+와 같은 “onco-metabolite”가 이와 같은 조절에 관여함을 확인 하였다. 두 번째로, 암세포에서의 glycolysis와 pentose phosphate pathway (PPP) 간의 당 대사 조절의 인자로 Snail과 PFKP가 관여함을 확인 하였다. 이를 통해, Snail에 의한 glycolysis의 억제와 PPP로의 당 대사의 흐름은 암세포에게 생존에 유리한 환경을 조성하고 있음을 확인 하였다.
본 박사학위 논문에서는 NMR과 MS를 기반으로 한 대사체 프로파일링 기법을 다양한 질환에 적용하여, 잠재적인 대사체 바이오마커를 발굴 하였으며, 질환으로 인한 변화 메커니즘을 규명하였다. 본 연구들을 통하여, 대사체 프로파일링 기법이 신장질환, 심혈관계질환, 암 질환 등의 주요 질환 연구에 적용이 가능함을 확인 하였으며, 다양한 질환 연구를 위한 대사체 프로파일링 기법의 유용성을 제시하였다.

With the great interest in detection, prediction and monitoring of human disease, and the recent
advent of “-omics” technologies, applications of metabolomics for the study of diseases have been
suggested. Metabolic profiling has been applied to discover potential biomarkers for diagnosing early stage disease, predict the stages and/or bad outcomes of diseases and identify biological functions and pathways. Metabolomics is a scientific study of measuring quantitative variance in metabolite levels response to alterations in the pathophysiological stimuli, genetic effects, and environmental variations in a given biological context. Because the metabolites in biological cell, tissue, organ or organisms are the end products of cellular processes, metabolomics is the closest link to phenotype compared to
other “-omics” technologies such as genomics, transcriptomics and proteomics. In the present PhD
project, metabolomics approaches were applied to discover potential biomarkers and identify pathways underlying diseases such as kidney disease, cardiovascular disease and cancer.
In study 1, NMR-based metabolic profiling was applied to investigate changes in serum from diabetic and non-diabetic patients with chronic kidney disease. Multivariate analysis showed that serum metabolites were altered according to CKD stages. In the CKD patients, associations were seen with clinical characteristics, hyperglycemia, altered amino acid metabolism, accumulated uremic
toxins, and dyslipidemia. Of interest, diabetes more strongly affected the metabolic phenotypes of
CKD patients at an early stage than advanced stages. In addition, serum metabolite profiles enabled to
predict the development of CKD and kidney function.
Myocardial infarction (MI) is a major cause of morbidity and mortality worldwide. Because responses to the cardiovascular disease (CVD) vary between men and women, considering gender differences is important when assessing outcomes after therapy, drug discovery, and development, as well as for understanding the pathophysiology of CVD. In study 2, LC/MS-based metabolomics application was performed to clarify the mechanism underlying MI, and to evaluate the significant metabolites and their possible gender-dependent differences by applying diverse statistical methods.
The partial least-squares discriminant analysis (PLS-DA) score plots showed a significant MI- and gender-related differences. Many pathways were associated with amino acids and purines; amino acids, acylcarnitines, and purines differed significantly between male and female patients with MI.
These findings highlighted the importance of gender differences in the development of MI. This study presented the potential utility of metabolomics in the diagnosis of disease, monitoring of related risk factors, and design of therapeutics.
Cancer cell survival overcoming metabolic stress is a critical step not only for solid tumour growth but also metastatic progression. Malignant progression requires coordinated adaptation of cellular metabolism that alters the physiology of transformed cells providing selective advantages. In study 3, NMR- and MS-based metabolic profiling combined with cell biology was performed to
investigate a systematic characterization of the metabolic and signaling pathways altered in cancer invasion and survival in response to metabolic stress. First, the integrated metabolome and transcriptome analyses revealed that the WNT signaling pathway mediated metabolic reprogramming, which generated abnormal NAD pathway metabolites in cancer stem-like cells (CSCs). These results suggested that NAAD+ was an “oncometabolite” from cross talk between the deranged core cancersignaling pathways and metabolic pathways providing a selective advantage to CSCs. Second,
pentose phosphate pathway (PPP) was enhanced by the activation of Snail in MDA-MB 231 cancer cells, indicating cancer cells reprogramed their metabolism to be survived in a resource-limited microenvironment via increased glucose flux into PPP.
In the present PhD project, NMR- and MS-based metabolomics approaches can be applied to clinical implications and mechanism studies in cell biology, and metabolic profiling is a useful tool in disease research to discover potential biomarkers, diagnose early stage disease, and identify biological function and pathways.

#대사체학 #질환 #핵자기공명분광기 #질량분석기

Ⅰ. Introduction 1
1. Metabolomics studies in disease 1
1.1. Kidney disease 1
1.2. Cardiovascular disease 3
1.3. Cancer 4
2. Analytical platform for metabolome analysis 8
2.1. Nuclear magnetic resonance spectroscopy 8
2.2. Mass spectrometry 9
3. Metabolomic data analysis and interpretation 11
3.1. Data pre-processing 14
3.2. Multivariate analysis 22
3.2.1. Principal component analysis 22
3.2.2. Partial least squares-discriminant analysis 25
3.2.3. Interpretation 29
3.2.4. Model validation 30
4. Reference 33
Ⅱ. Metabolomics study of chronic kidney disease: Comparison of diabetes and non-diabetes and prediction of the progression 38
1. Introduction 38
2. Materials and methods 40
3. Results 43
4. Discussion 74
5. Reference 77
Ⅲ. Metabolic profiling reveals gender differences in serum from patients with myocardial infarction 83
1. Introduction 83
2. Materials and methods 85
3. Results 93
4. Discussion 113
5. Reference 118
Ⅳ. Metabolomics study reveals metabolic reprogramming in cancer cell under metabolic stress 128
1. Introduction 128
2. Materials and methods 130
3. Results 141
3.1 Metabolic and transcriptomic profiling reveals metabolic reprogramming in cancer stem-like cells 141
3.2 Metabolic profiling reveals glucose flux towards pentose phosphate pathway in cancer cell under metabolic stress 166
4. Discussion 180
5. Reference 184
Ⅴ. Conclusion 192
Ⅵ. 국문요약 194

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