Analysis of glycan profile and glycosylation site occupancy using a combination of analysis strategies :다양한 분석 전략을 통한 당사슬 구조 및 당자리 분석

오현일

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자료유형: 학위논문

저자정보: 오현일 (중앙대학교, 중앙대학교 대학원)

지도교수: 김하형

발행연도: 2016

저작권: 중앙대학교 논문은 저작권에 의해 보호받습니다.

이용수6

초록· 키워드

당화는 단백질의 전사후 과정(post-translational modification) 중에서도 가장 흔하고 필수적인 변형 중 하나이다. N-당사슬의 구조와 당자리는 다양한 생물학적 기능에 있어서 핵심적인 역할을 수행한다. 이러한 당사슬의 구조와 당자리의 분석을 위해서 다양한 방법들이 개발되어왔다. 이와 더불어 데이터 해석의 자동화를 위한 노력이 계속되어왔다. 본 연구의 목적은 N-당사슬의 구조와 당자리 분석을 다양한 전략으로 분석하여 그 성능을 확인하고, 새로운 반자동 데이터 처리 방법을 제안함에 있다. Fetuin, a monoclonal antibody, horseradish peroxidase는 그 특성이 잘 알려진 당단백질이므로 이들을 시료로 선정하였다. 시료들은 peptide-N-glycosidase로 당사슬을 분리한 뒤 유도체화하였다. 이어 NP-HPLC와 MALDI-TOF MS를 통해 당사슬 구조의 분석을 행하였다. 당단백질 시료들은 환원과 알킬화 이후 효소분해 및 당사슬 분리과정을 거쳤다. 처리된 시료들을 UPLC-PDA-ESI-HCD-MS/MS로 시험하여 당자리를 분석하였다. 당사슬 분리를 거치지 않은 intact glycopeptide 시료 또한 UPLC-PDA-ESI-HCD-MS/MS로 시험하였으며, 시험 결과는 첫째, SEQUEST 소프트웨어를 이용한 방식과 둘째, MS-Filter와 MAGIC 소프트웨어를 활용한 새로운 방식으로 분석하였다. 당사슬 구조 분석 및 당자리 분석 결과, 다수의 당사슬 구조를 확인했으며 잠재적인 당자리를 모두 확인하였다. MS-Filter 및 MAGIC 소프트웨어를 이용한 glycopeptide 분석을 통해서 당자리에 특이적인 당사슬 구조를 확인하였다. 이러한 결과는 분석전략의 연동을 통해 당사슬에 대한 다양한 정보를 확인할 수 있다는 것을 의미한다.

Glycosylation is one of the most common and essential post-translational modifications of proteins. The N-linked glycan profile and glycosylation site occupancy plays a crucial role in biological functions. Various analysis strategies have been developed to characterize glycan profile and glycosylation site occupancy. Along with the analysis strategies, software tools for automated interpretation of tandem mass data have been advanced. The objectives of this study is to confirm a systemic workflow of N-linked glycan profile analysis and glycosylation site occupancy analysis using a combination of analysis strategies. In addition, a platform based on a combination of conventional software tools was devised and investigated to filter the tandem mass data. Fetuin, monoclonal antibody and horseradish peroxidase were selected to identify their N-linked glycan profile and glycosylation site occupancy, and the glycoproteins were treated with peptide-N-glycosidase A to detach the N-linked glycans. The released N-linked glycans were derivatized and analyzed using normal phase-high-performance liquid chromatography and matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry for glycan profiling. Additionally, the glycoproteins were reduced and alkylated, and enzymatic digestion using trypsin and chymotrypsin with or without deglycosylation were followed by detection using ultra-performance liquid chromatography-photodiode array-electrospray ion source-high energy collision-tandem mass spectrometry. Intact glycopeptides were then analyzed and the data was interpreted in two different ways: SEQUEST-based data process or semi-automatic process with MS-Filter and MAGIC which are publicly available. All of the major N-linked glycan profiles and glycosylation sites were identified by analysis of released N-linked glycans and deglycosylated peptides, respectively. Furthermore, site-specific glycan structures were obtained through the analysis of intact glycopeptides. Faster and more precise analysis of intact glycopeptides were achieved by the combination of MS-Filter and MAGIC compared to SEQUEST. The present results indicate that abundant glycosylation information could be obtained by using multiple glycosylation analysis strategies, and better data interpretation could be accomplished by the assistance of automation tools.

#analysis #glycan #glycosylation site occupancy #glycopeptide

I. Introduction 1
II. Materials and methods 5
1. Sample preparation and electrophoresis 5
2. N-linked glycan profile analysis 5
2.1. N-linked glycan release by enzymatic deglycosylation 5
2.2. 2-AB labeling and solid-phase permethylation of N-linked glycans 6
2.3. NP-HPLC analysis of 2-AB-labeled glycans 7
2.4. MALDI-TOF MS analysis of 2-AB-labeled or permethylated glycans 8
3. N-linked glycosylation site occupancy analysis 9
3.1. Reduction and alkylation (RA) 9
3.2. Dialysis 9
3.3. Proteolytic digestion 10
3.4. Electrophoresis 10
3.5. N-linked glycan release by enzymatic deglycosylation 10
3.6. UPLC-PDA-ESI-HCD-MS/MS 11
3.7. Data analysis 12
III. Results 15
1. Sample preparation and N-linked glycan profile analysis 15
2. N-linked glycosylation site occupancy analysis 16
2.1. Electrophoresis 16
2.2. UPLC-PDA 16
2.3. UPLC-ESI-HCD-MS/MS analysis of deglycosylated peptides 17
2.4. UPLC-ESI-HCD-MS/MS analysis of intact glycopeptides 18
IV. Discussion 44
V. References 48
VI. 국 문 초 록 55

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