Cloning, expression and characterization of β-agarase from Thalassotalea agariperforans M-M1 with high agarolytic activity :

하민지

자료유형: 학위논문

저자정보: 하민지 (성균관대학교, 성균관대학교 일반대학원)

지도교수: 윤정훈

발행연도: 2017

저작권: 성균관대학교 논문은 저작권에 의해 보호받습니다.

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초록· 키워드

한천을 분해하는 특성을 가진 Thalassotalea agariperforans M-M1은 거제도 해안가에서 분리되었다. 이 균주의 유전자 염기 서열과 아미노산 서열을 비교한 결과 Glycoside hydrolase 50 family에 속한다는 것을 확인하였고, 효소의 이름은 AgaM1으로 명명하였다. 19개의 signal peptide를 제외한 뒤 유전자 클로닝을 통해 대장균에서 단백질을 과발현 시켰으며, 정제를 통하여 86 kDa 으로 발현된 단백질을 확인하였다. AgaM1의 특성 분석 결과 최적 온도는 35 ℃, 최적 pH는 pH 6.0으로 나타났고, 비교적 저온인 20-35 ℃에서 12시간 방치 후에도 활성이 유지되었다. AgaM1은 4-nitrophenyl-β-D-galactophyranoside는 분해하는 반면에 4-nitrophenyl-α-D-galactophyranoside는 분해하지 못한 결과를 통해 β형 결합을 분해하는 β 아가레이즈임을 확인하였다. 아가레이즈의 Km값과 Vmax값은 각각 2.33 mg/ml 과 166.67 U/mg로 측정되었다. 금속이온과 EDTA에 대해서는 대체로 안정적인 반면에 중금속 이온과 계면활성제에 의해서는 활성이 저해되었다. AgaM1에 의한 최종 분해산물은 neoagarobiose라는 것을 확인하였다.

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Ⅰ. Introduction
Ⅱ. Materials and Methods
1. Bacterial strains and plasmids
2. BLAST and phylogenetic analysis of the agaM1 genes
3. Cloning of the agaM1 genes
4. Overexpression and purification of AgaM1
5. SDS-PAGE, Native-PAGE and Zymogram assay
6. Enzyme activity assay
7. Effects of temperature and pH
8. Effects of various reagent
9. Substrate specificity
10. Estimation of kinetic parameters
11. Structural analysis of the hydrolysis product
Ⅲ. Results
1. Sequence analysis of AgaM1
2. Cloning, expression and purification of the recombinant AgaM1
3. Characterization of AgaM1
3.1 Temperature profile
3.2 pH profile
3.3 The effect of various metal ions on agarase activity
3.4 The effect of inhibitors on agarase activity
3.5 The effect of detergents on agarase activity
3.6 Substrate specificity
3.7 Enzyme kinetics
3.8 Analysis of the hydrolysis product by AgaM1
Ⅳ. Discussion
Ⅴ. References
Ⅵ. 국문요약 (초록)

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