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논문 기본 정보
- 자료유형
- 학위논문
- 저자정보
- 지도교수
- 송형근
- 발행연도
- 2017
- 저작권
- 충북대학교 논문은 저작권에 의해 보호받습니다.
이용수25
초록· 키워드
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Intercellular adhesion molecule 4 (ICAM4)는 인간 적혈구의 성숙단계에서 인접한 적혈구의 VLA-4와 대식세포의 αv인테그린과 결합하여 적혈구를 안정화시키는 역할을 하는 적혈구 막 당단백질이다. 이전 연구를 통해서 여러 백혈병 세포주에서 ICAM4가 과발현 됨을 알았고, ICAM4에 대한 마우스 단클론 항체 1E1을 개발하였다. 항-ICAM4 마우스 단클론 항체 1E1은 적백혈병 세포주에서 항체 의존성 세포독성 및 항체 의존성 세포식작용 검사에서 유효성을 보였다.
본 연구에서는 항-ICAM4 마우스 단클론 항체 1E1을 기본으로 하는 키메릭 항체, 인간화항체, 항체-약물 복합체 등 다양한 형태의 항-ICAM4 항체치료제를 개발하였다. 먼저 항-ICAM4 키메릭 항체를 대량 생산 할 수 있는 안정화된 세포주를 제작하였다. 안정화된 세포주를 제작하기 위해서 발현벡터로 pOptiVEC과 pcDNA3.3을 사용하였고, 호스트 세포주로 CHO DG44를 사용하였다. 최종적으로 1000 nM MTX와 200 μg/mL G418이 첨가된 배지에서 7.5 mg/L의 항-ICAM4 키메릭 항체를 생산하는 안정화된 세포주를 얻었다. 안정화된 세포주로부터 생산된 항-ICAM4 키메릭 항체는 본래의 마우스 단클론 항체와 매우 유사한 친화력으로 ICAM4에 결합하였다. 두 번째로 키메릭 항체의 면역원성을 줄이고, 물성 및 항원 친화도 측면으로 더 우수한 항체를 개발하기 위해 CDR 이식 방법을 통하여 항-ICAM4 인간화항체를 제작하였다. 가상세포시스템(in silico)으로 104개 조합의 인간화항체 서열을 얻었고, 유전자 클로닝을 통하여 기존 키메릭 항체와 유사한 친화력을 보이는 클론을 다수 확보하였다. 마지막으로 항-ICAM4 항체치료제의 가장 큰 특성 중에 하나인 세포내재화를 이용하는 항-ICAM4 항체-약물 복합체를 개발하였다. 기존 여러 논문 및 임상시험에서 효능이 검증된 사포린과 엠탄신을 약물로 사용하였으며 생체 내외 실험에서 그 효능을 확인하였다.
그 밖에 항-ICAM4 항체치료제가 정상 적혈구에 결합하여 생길 수 있는 부작용을 줄이기 위하여 뉴라민가수분해효소를 농도별로 암세포주와 정상 적혈구에 처리하여 세포 표면의 시알산의 차이를 유도하였고, 항-ICAM4 항체가 암세포주에는 반응하지만 정상 적혈구에는 반응하지 못하는 뉴라민가수분해효소의 농도를 알아내었다. 암세포와 정상 적혈구가 혼재되어 있는 환경에서 세포 표면의 시알산의 차이를 유도하여 항-ICAM4 항체치료제가 정상 적혈구에 대한 반응성은 줄고 암세포에 대한 반응성이 증가함을 확인하였다. 추가로 항-ICAM4/CD43 이중특이성 항체를 제작하여 정상 세포에는 결합하지 않고 암세포만 특이적으로 결합할 수 있는 가능성을 제시하였다. 항체치료제 개발단계에서 고려해야 사항인 항-ICAM4 항체의 조직교차반응을 확인 한 결과 태아조직 및 성인 간, 신장, 자궁 등 검사를 시행한 모든 조직에서 음성결과를 얻었고, 백혈병에 국한되어 있는 치료 적응증을 넓히기 위해 여러 인간 유래 암세포주와 임상 시료의 선별작업을 진행하여 일부 간암세포주와 담관암세포주와 골수형성이상증후군(MDS)환자의 골수성미성숙세포(myeloblast)에서 인간 ICAM4가 발현됨을 알았다.
결론적으로 ICAM4가 우수한 항체치료제의 표적이 될 수 있음을 검증하였고, ICAM4를 표적으로 하는 여러 형태의 항체치료제를 개발하였다.
본 연구에서는 항-ICAM4 마우스 단클론 항체 1E1을 기본으로 하는 키메릭 항체, 인간화항체, 항체-약물 복합체 등 다양한 형태의 항-ICAM4 항체치료제를 개발하였다. 먼저 항-ICAM4 키메릭 항체를 대량 생산 할 수 있는 안정화된 세포주를 제작하였다. 안정화된 세포주를 제작하기 위해서 발현벡터로 pOptiVEC과 pcDNA3.3을 사용하였고, 호스트 세포주로 CHO DG44를 사용하였다. 최종적으로 1000 nM MTX와 200 μg/mL G418이 첨가된 배지에서 7.5 mg/L의 항-ICAM4 키메릭 항체를 생산하는 안정화된 세포주를 얻었다. 안정화된 세포주로부터 생산된 항-ICAM4 키메릭 항체는 본래의 마우스 단클론 항체와 매우 유사한 친화력으로 ICAM4에 결합하였다. 두 번째로 키메릭 항체의 면역원성을 줄이고, 물성 및 항원 친화도 측면으로 더 우수한 항체를 개발하기 위해 CDR 이식 방법을 통하여 항-ICAM4 인간화항체를 제작하였다. 가상세포시스템(in silico)으로 104개 조합의 인간화항체 서열을 얻었고, 유전자 클로닝을 통하여 기존 키메릭 항체와 유사한 친화력을 보이는 클론을 다수 확보하였다. 마지막으로 항-ICAM4 항체치료제의 가장 큰 특성 중에 하나인 세포내재화를 이용하는 항-ICAM4 항체-약물 복합체를 개발하였다. 기존 여러 논문 및 임상시험에서 효능이 검증된 사포린과 엠탄신을 약물로 사용하였으며 생체 내외 실험에서 그 효능을 확인하였다.
그 밖에 항-ICAM4 항체치료제가 정상 적혈구에 결합하여 생길 수 있는 부작용을 줄이기 위하여 뉴라민가수분해효소를 농도별로 암세포주와 정상 적혈구에 처리하여 세포 표면의 시알산의 차이를 유도하였고, 항-ICAM4 항체가 암세포주에는 반응하지만 정상 적혈구에는 반응하지 못하는 뉴라민가수분해효소의 농도를 알아내었다. 암세포와 정상 적혈구가 혼재되어 있는 환경에서 세포 표면의 시알산의 차이를 유도하여 항-ICAM4 항체치료제가 정상 적혈구에 대한 반응성은 줄고 암세포에 대한 반응성이 증가함을 확인하였다. 추가로 항-ICAM4/CD43 이중특이성 항체를 제작하여 정상 세포에는 결합하지 않고 암세포만 특이적으로 결합할 수 있는 가능성을 제시하였다. 항체치료제 개발단계에서 고려해야 사항인 항-ICAM4 항체의 조직교차반응을 확인 한 결과 태아조직 및 성인 간, 신장, 자궁 등 검사를 시행한 모든 조직에서 음성결과를 얻었고, 백혈병에 국한되어 있는 치료 적응증을 넓히기 위해 여러 인간 유래 암세포주와 임상 시료의 선별작업을 진행하여 일부 간암세포주와 담관암세포주와 골수형성이상증후군(MDS)환자의 골수성미성숙세포(myeloblast)에서 인간 ICAM4가 발현됨을 알았다.
결론적으로 ICAM4가 우수한 항체치료제의 표적이 될 수 있음을 검증하였고, ICAM4를 표적으로 하는 여러 형태의 항체치료제를 개발하였다.
목차
- Introduction 1Materials and Methods 3Results . 7Discussion 24Summary 28References 29
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