우리나라 굴에서의 노로바이러스 검출과 유전적 특성분석, 그리고 Surrogate를 이용한 굴김치의 안전성 검증 :

신순범

학위논문

저자정보: 신순범 (부경대학교, 부경대학교 대학원)

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본 주제는 최근 전 세계적으로 패류(굴) 위생에 있어 가장 큰 문제로 부각되고 있는 노로바이러스에 관한 연구 결과이다.
본 연구에서는 우리나라 남해안에서 생산되는 굴을 대상으로 장관계바이러스 5종(노로바이러스, 엔테로바이러스, 로타바이러스, 아스트로바이러스 및 A형 간염 바이러스)의 오혐현황을 파악하였다. 또한 굴에서 검출되는 노로바이러스의 유전형을 동정하고 굴에서 축적되는 바이러스의 농도를 확인하였으며 노로바이러스의 대체모델(surrogate)를 활용하여 굴이 부재료로 첨가된 김치에서의 노로바이러스 안전성을 검증하고자 하였다.
2009년 1월에서 2011년 12월까지 남해안 인근 굴 양식장 9지점에서 총 398개의 참굴을 대상으로 노로바이러스를 분석하였으며, 그 중 91개 시료로 부터 엔테로바이러스, 로타바이러스, 아스트로바이러스 및 A형 간염 바이러스를 분석하였다. 그 결과, 노로바이러스는 27.4%(109/398), 아스트로바이러스는 1.1% (1/91)의 검출율을 나타내었으며 엔테로바이러스, 로타바이러스, 아스트로바이러스 및 A형 간염 바이러스는 검출되지 않았다.
노로바이러스가 검출된 24개 시료로 부터 유전형을 동정하기 위하여 샘플 당 5개의 clone (총 120)을 sequencing하여 염기서열을 분석하였다. 그 결과, 노로바이러스 GI에서는 5개의 유전형(GI.1, GI.2, GI.5, GI.6, GI.7)이 동정되었으며, GII에서는 7개의 유전형(GII.2, GII.3, GII.4, GII.7, GII.12, GII.13, GII.17)이 동정되었다. 조사기간 중 GI에서는 GI.1형(52.6%, 10/19), GII에서는 GII.3 및 GII.4형(각각 30.0%, 6/20)이 가장 유행하는 유전형으로 확인되었다.
2012년 1월부터 12월까지 채취된 21개의 굴 샘플에서 real-time RT-PCR을 이용하여 바이러스 유전자를 정량적으로 분석하였으며, 노로바이러스가 검출된 샘플의 농도는 8.97 x 102～7.47 x 101 copies/g으로 나타났다. GI형이 8.97 x 102～2.24 x 102, GII형이 3.05 x 102～7.47 x 101 copies/g으로 모든 샘플이 103 copies/g이하의 농도에서 검출되었으며, 102 copies/g보다 낮은 농도로 검출된 샘플이 9.5% (2/21)로 확인되었다.
그리고 30일간의 자연감염을 통하여 굴에서의 검출된 노로바이러스 농도는 GI, 6.91 x 103 ∼ 2.43 x 105 및 GII, 5.37 x 105 ∼ 9.19 x 106 이었으며, 노로바이러스에 자연감염된 굴을 각 구간별로 가열처리 한 결과, 60, 68, 70℃에서 처리한 결과 GI형이 각각 83.4, 88.0, 89.4% 감소되었으며, GII형은 60, 68, 70, 100℃에서 각각 67.3, 76.3, 80.1, 89.8% 감소되는 것으로 확인되었다.

굴김치에서 노로바이러스의 안전성을 검증하기 위하여 노로바이러스 대체모델(Surrogate)인 Feline calicivirus (FCV)를 이용하여 김치 숙성 중 일어나는 바이러스의 감염가의 변화를 확인하였다. 그 결과, 6.30 TCID50인 FCV는 25℃에서 4일 후에 2.30 TCID50으로 감소하였고 18℃에서 4일 후에 3.55 TCID50으로 감소하였으며, 4℃에서는 5일 후에 4.05로 감소되는 것이 확인되었다.
또한 김치와 관련된 유기산 및 김치 양념원료의 FCV 불활성화 작용력을 확인 한 결과, 바이러스의 감염력 감소에 영향을 미치는 주요 인자는 유기산의 종류에 상관없이 숙성과정 중 유도된 낮은 pH 환경이며, 더불어 주재료 및 부재료에서 유래하는 항 바이러스성 물질의 작용도 일부 기여하는 것으로 확인되었다. 즉 충분히 숙성된 김치(상온에 2일 이상 숙성)의 경우 부원료로 사용된 굴에서 유래하는 노로바이러스에 의한 2차 감염의 가능성은 매우 낮은 것으로 확인되었다.
이러한 결과들은 노로바이러스 원인이 되는 분변 오염원의 관리, 질병 발생시 역학조사, 식품에서의 노로바이러스 정량 기준 설정 및 위해평가를 위한 기초자료이며 노로바이러스 오염이 의심되는 식품에서의 섭취 가이드라인을 제시한 결과라 할 수 있다.

In this study, we investigated the enteric viruses (norovirus, enterovirus, rotavirus, astrovirus and hepatitis A virus) contamination status of oysters produced in southern coast of Korea. We also identified the genotypes of Norovirus (NoV) detected in oysters and confirmed the concentration of virus accumulated in oysters. In addition, we tried to verify the safety of NoV in oyster kimchi by using NoV surrogate, Feline calicivirus (FCV).
From January 2009 to December 2011, NoV was analyzed from 398 oysters from 9 stations in the south coast, and 91 samples were analyzed for enterovirus, rotavirus, astrovirus and hepatitis A virus.
As a result, the detection rate of NoV was 27.4% (109/398) and astrovirus was 1.1% (1/91). And enterovirus, rotavirus and hepatitis A virus were not detected.
In order to identify genotypes, 120 clones (5 clones per sample) from 24 NoV-positive samples were sequenced and evaluated. Based on the sequencing results, five genotypes (GI.1, GI.2, GI.5, GI.6, and GI.7) were identified in NoV Genogroup I, and seven genotypes (GII.2, GII.3, GII.4, GII.7, GII.12, GII.13, and GII.17) in NoV Genogroup II. GI.1 (52.6%; 10 of 19) and both GII.3 and GII.4 (30.0%; 6 of 20, respectively) were identified as the most prevalent Genogroup I and II strains in oyster during the investigation period.
NoVs were quantitatively analyzed from 21 oysters collected from January to December 2012, using real-time reverse transcription?polymerase chain reaction. and we assessed the NoVs concentration after naturally-contamination and heating to investigate the effects of heat treatment on NoV infected oysters.
In NoV-positive samples, viral concentrations were 8.97 × 102 to 2.24 × 102 and 3.05 × 102 to 7.47 × 101 copies/g for genogroup I and II, respectively. All samples were detected at concentrations below 103 copies/g and samples detected at concentrations lower than 102 copies/g were confirmed to be 9.5% (2/21). The results of the natural infection for 30 days showed that the concentrations of NoV detected in the oysters were 6.91 x 103 to 2.43 x 105 and 5.37 x 105 to 9.19 x 106, respectively. After heat treatment, genogroup I decreased by 83.4%, 88.0%, 89.4% and 100% at 60°C, 68°C, 70°C, and 100°C, respectively, for 15 min, while genogroup II respectively decreased by 67.3%, 76.3%, 80.1%, and 89.8% under the same conditions.
In order to verify the safety of NoV in the oyster-kimchi, we investigated the changes of viral infectivity during Kimchi ripening using NoV surrogate, feline calicivirus (FCV).
As a result, it was confirmed that the FCV of 6.30 TCID50 decreased to 2.30 TCID50 after 4 days at 25℃, decreased to 3.55 after 4 days at 18℃, and decreased to 4.05 after 5 days at 4 ℃. And as a result of confirming the effect of organic acid and raw material related to kimchi, The main factor decreasing the infectivity of FCV in Kimchi was the high acidity caused by organic acids, regardless of the type, produced by ripening. Furthermore, it was confirmed that antiviral materials originating from raw material such as salt-fermented anchovies and garlic might contribute to the decreased infectivity of FCV.

I. 서 론 1
II. 본 론 7
제 1장 우리나라 양식굴의 장관계 바이러스 오염현황 조사 7
1. 서론 7
2. 재료 및 방법 13
2.1. 시료 샘플링 13
2.2. Virus extraction 15
2.3. RNA extraction 17
2.4. RT-PCR 18
2.5. Real-time RT-PCR 20
3. 결과 및 고찰 23
3.1. 남해안 양식굴의 장관계 바이러스 오염현황 23
3.1.1. 노로바이러스 23
3.1.2. 엔테로, 로타, 아스트로 및 A형 간염 바이러스 30
제 2장 굴에서 검출되는 노로바이러스의 유전적 다양성 분석 32
1. 서론 32
2. 재료 및 방법 38
2.1. 시료 샘플링 38
2.2. Cloning, sequencing and phylogenetic analysis 40
2.2.1. Gel elution 41
2.2.2. Transformation 42
2.2.3. Plasmid extraction 43
2.2.4. Sequencing 및 염기서열 분석 44
3. 결과 및 고찰 45
제 3장 굴에 축적되는 노로바이러스의 농도에 관한 고찰 54
1. 서론 54
2. 재료 및 방법 56
2.1. 시료 샘플링 56
2.2. 노로바이러스 인위감염 및 가열처리 조건 58
2.3. 위생지표세균 분석 59
2.4. 노로바이러스 분석 60
2.4.1. Virus extraction 및 RNA extraction 60
2.4.2. 표준곡선 산출 61
2.4.3. Real-time RT-PCR 62
3. 결과 및 고찰 65
3.1. 전처리법의 간소화 및 Real-time RT-PCR 65
3.2. Real-time RT-PCR을 이용한 노로바이러스 검출 및 정량분석 69
3.3. 자연감염을 통한 노로바이러스의 농도변화 76
3.4. 가열처리에 따른 노로바이러스 농도 변화 83
제 4장 대체 모델(Surrogate)를 이용한 식품에서의 노로바이러스 불활성화 87
1. 서론 87
2. 재료 및 방법 90
2.1. Feline calicivirus의 배양 90
2.2. 김치 및 유기산 91
2.3. 시판 및 조제 김치, 부재료와 FCV의 혼합 92
2.4. Feline calicivirus 감염가 측정 95
3. 결과 및 고찰 96
3.1. 김치 숙성 과정에서의 FCV 감염력 변화 96
3.2. 유기산 및 양념류에 의한 FCV의 불활성화 104
III. 요약 109
IV. 감사의 글 112
VI. 참고 문헌 114

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