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논문 기본 정보
- 자료유형
- 학위논문
- 저자정보
- 지도교수
- Hong Soon-Kwang
- 발행연도
- 2018
- 저작권
- 명지대학교 논문은 저작권에 의해 보호받습니다.
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Gayadomonas joobiniege G7 균주의 알파 네오아가로올리고사카라이드 하이드로레이즈 효소에 관한 분자생화학적 연구
사지다 아스가
명지대학교 대학원 생명과학정보학과
지도교수 홍순광
해양에서 매우 풍부한 바이오 매스는 홍조류 (Rhodophyta)의 세포벽에서 중요한 구성 성분인 한천이며 주요 갈락탄 탄수화물입니다. 미생물은 해양 바이오 매스의 분해 및 재활용을 위해 분비되는 agarolytic 효소 때문에 전 세계 탄소 순환에서 중요한 역할을 합니다. 가장 잘 알려진 미생물의 agarolytic 경로는 다양한 경우에서 β-(1,4) glycosidic linkages(d-Gal-β(1,4)-AHG)를 파괴하는 β-agarases(EC 3.2.1.81)를 이용한다. 생성된 neoagarooligossaccharides는 α-neoagarobiose(O-3,6-anhydro-alpha-L-galactopyranosyl-(1,3)-D-galactose)를 α-neoagarobiose (NABH) / NAOS 가수 분해 효소로 변환시킴으로써 agarolytic pathway에서 필수적이고 중요한 효소인 fermentable monosaccharides (D-galactose and 3,6-anhydro-L-galactose)로 전환시킵니다.
AOSs, NAOSs, Neoagarobiose (NAB), AHG와 같은 한천의 당류는 항염증제, prebiotics, 미백, 보습 및 항우울증과 같은 다양한 생리 활성을 가지고 있습니다.
Gayadomonas joobiniege G7은 가야 (Gaya) 섬의 연안 해수 시료에서 발견 된 새로운 속 (genus)에 속하는 한천 분해성 해양 박테리아입니다. 이는 그람 음성으로 막대 모양이고 호기성이며 비 운동성 및 색소가 없습니다. 그것은 황화 조류 다당류의 완전한 파괴에 중요한 가수 분해 효소를 암호화하는 많은 유전자를 가지고 있으며 바이오 연료 생산을 위한 바이오 자원으로 간주됩니다. 그래서 본 연구에서 3개의 α-NABH/NAOS 유전자(ahg558, ahg786, ahg943)를 연구했습니다.
Ahg558은 glycosyhydrolase로 유전자 길이가 1080bp이고, 이론적인 mol의 무게는 40.84k Da입니다. 이것은 또한 다른 종의 특징적인 α-NABH / NAOS 유전자와 높은 상동성을 보였습니다. 이런 특징들을 연구하기 위해, 유전자를 pET28a(+) 벡터에 클로닝하고 대장균 ER2566 균주에서 발현시켰습니다. 발현된 단백질은 TALON 레진으로 용해되고 정제했습니다. 이렇게 정제된 단백질은 neoagarobiose, neoagarotetraose 및 neoagarohexaose를 가수 분해 했습니다. 이것은 0.2% 아가로오스에서는 비활성 상태를 유지했습니다. 그리고 neoagrobiose와 함께 밤새 배양하면 D-Galactose와 3,6 AHG가 생성됩니다. 그것은 또한 3,6 AHG와 agarotriose와 neoagarohexaose를 생산하는 neoagarotetraose를 분해시켰으며 3,6 AHG와 agaropentaose를 생성하는 것으로 보아 exo-acting alpha-neoagarobiose hydrolase임을 확인했습니다. pH 9.0 (Glycine-NaOH) 및 30 ℃의 알칼리성 범위에서 최대 활성을 보였습니다. 겔 침투 크로마토그래피는 이를 2량체로 나타냈고, Km 및 Vmax 값은 각각 2.6mg/ml 및 2x103μM/min이었습니다. 금속 이온 효과를 위해 처리 하였을 때는 1mM Mn2?이온에 대해 161%의 활성을 보였고, EDTA는 최종 농도 0.5mM 및 5Mm에서 효소 활성에 강하게 영향을 미쳤습니다.
두 번째 유전자 인 ahg786은 Gayadomonas joobiniege G7 게놈 데이터에서 보고되었으며, glycosyl hydrolase로 해석이 되었습니다. 다른 종의 특징적인 α-NABH / NAOS 유전자와 높은 상동성을 보였고, 그것은 pET28a(+) 벡터에 클로닝하여 N-말단에 his-tag를 갖는 대장균 균주 로제타 가미 (Rosetta gami)에서 발현시켰습니다. 그것에는 (1-25 아미노산) 신호 펩티드가 있습니다. 과발현된 수용성 단백질은 TALON 레진 크로마토그래피로 정제하였습니다.
neoagarobiose, neoagarotetraose 및 neoagarohexaose와 D-Galactose, agarotriose 및 agaropemtaose등의 다른 가수 분해 생성물은 모두 공통적으로 가수 분해 생성물 3,6 AHG를 생산했습니다. 또한 이 작용 방식으로 그것이 α-NABH/NAOS 가수 분해 효소임을 확인했습니다. 최적 온도와 pH는 각각 15 ℃와 7.0이고, Km 및 Vmax 값은 1.46mg/ml 및 133.33μM/min입니다. 그 활성은 최종 농도 5mM에서 EDTA에 의해 강력하게 영향을 받았고, 1mM Mn2?이온은 촉매 활성을 증가시켰습니다. 겔 침투 크로마토그래피는 이것을 2량체로 나타냈습니다.
세 번째 유전자 ahg943은 Gayadomonas joobiniege G7의 가설적인 단백질입니다. 유전자의 길이는 1272bp이고 423개의 아미노산을 가지고 있고, mol의 무게는 47.96kDa입니다. Saccharophagus degradans 2-40 및 Zobellia galactanivorans와 각각 36% 및 40%의 동일성을 보였으며, 각각 α-NABH를 가지는 특징을 보였습니다. 이를 pET28a(+) 벡터에 클로닝시키고, N-말단에 his-tag를 갖는 E.coli 균주 ER2566에서 발현시켰습니다. 그것은 (1-22 아미노산) 신호 펩타이드를 가지고 있고, 과발현된 수용성 단백질은 TALON resin 크로마토그래피로 정제하였습니다. 레진에 결합하지 않고 흘러 손실된 대부분의 단백질은 레진에 histag가 없어서 발생할 수 있습니다. 특성화 연구를 통해 최대 단백질을 얻기 위해, 수용성 단백질을 최종 농도 2M urea로 처리하였습니다. 모든 단백질들은 2M의 urea를 처리 한 후에 레진에 결합한다. 초기 TLC에서는 가수 분해된 기질이 보여지는 것처럼 neoagarobiose에 대한 약한 활성을 보였습니다. 그러나 neoagarotetraose와 neoagarohexaose에 대해서는 완전한 분해가 나타납니다.
Neoagarobiose, Neoagarotetraose 및 Neoagarohexaose와 D-Galactose, agarotriose 및 agaropentaose와 같은 다른 가수 분해 생성물은 모두 공통적으로 가수 분해 생성물 3,6 AHG를 생산했습니다. 이로써 그것이 α-NABH / NAOS 가수 분해 효소임을 확인할 수 있었고, 최적 온도 및 pH는 각각 30 ℃ 및 6.0이었습니다. 그러나 이 단백질의 특성을 평가하기에는 값이 너무 작았습니다. 아마도 이 단백질은 특성화된 단백질이 가지는 다양한 아미노산 서열이 일부 아미노산 잔기에서 다른 점을 보이기 때문에 약한 단백질일수 있습니다.
Key words: Gayadomonas joobiniege G7, 알파네오아가로바이오스 하이드롤레이즈, Glycoside hydrolase family 117
Biochemical characterization of alpha-neoagarooligosaccharide hydrolases from Gayadomonas joobiniege G7
Sajida Asghar
Graduate School, Myongji University
Department of Biological Sciences
Advisor Hong Soon-Kwang
The highly abundant biomass in ocean is agar, major constituent in the cell wall of red algae (Rhodophyta) and is main galactan carbohydrate. Microorganisms play an important role in global carbon cycle because of agrolytic enzymes which they secrete for degradation and recycling of marine biomass. The most well-known microbial agarolytic pathway utilizes β-agarases (EC 3.2.1.81) which break β-(1,4) glycosidic linkages (D-Gal-β(1,4)-AHG) in various modes. The resulting neoagarooligossaccharides are degraded by α-neoagarobiose (NABH)/NAOS hydrolase, which is an essential and crucial enzyme in agarolytic pathway as it converts α-neoagarobiose (O-3,6-anhydro-alpha-L-galactopyranosyl-(1,3)-D-galactose) into fermentable monosaccharides (D-galactose and 3,6-anhydro-L-galactose).
Gayadomonas joobiniege G7 is an agar-degrading marine bacterium belonging to a novel genus identified from coastal sea water sample from Gaya Island, Korea. It is Gram-negative, rod shaped, aerobic, non-motile, and non-pigmented. It has many genes encoding hydrolytic enzymes important for complete breakdown of sulfated algal polysaccharides, and considered as a bioresource for biofuel production. The current study has focused three α-NAOS genes (ahg558, ahg786, ahg943) which belongs to GH 117 family.
Ahg558 is a glycosyhydrolase, having gene length of 1080bp. Theoretical mol.we-
ight is 40.84k Da. It showed high homology with characterized α-NABH/NAOS genes from other species. For the characterization studies, the gene was cloned in pET28a(+) vector and expressed in E.coli strain ER2566. The expressed protein was soluble and purified by TALON-resin. The purified protein hydrolyzed neoagarobiose, neoagarotetraose and neoagarohexaose. It remained non-active on 0.2%agarose. It produced D-Galactose and L-AHG when incubated overnight with neoagrobiose. It also degraded neoagarotetraose producing L-AHG and agarotriose and neoagarohexaose and produced L-AHG and agaropentaose confirming it to be an exo-acting α-NAOS hydrolase. It showed maximum activity in alkaline range in pH 9.0 and at 30°C. Gel permeation chromatography showed it to be a dimer. Km and Vmax values were 2.6 mg/ml (8.01mM) and 2x103 μM/min (133.33U/mg) respectively. When treated for metal ions effect, it showed 161% of activity for 1mM Mn2+ions. EDTA strongly affected the enzyme activity at 0.5mM and 5mM final concentration.
The second gene ahg786 was reported from Gayadomonas joobiniege G7 genomic data and annotated as a putative glycosyl hydrolase. It showed high homology with characterized α-NABH/NAOS genes from other species. It was cloned in pET28a(+) vector and expressed in E.coli strain Rosetta gami having N-terminal histag. It has a (1-25 amino acid) signal peptide. Soluble overexpressed protein was purified by TALON resin chromatography. One common hydrolysis product L-AHG was obtained for substrates neoagarobiose, neoagarotetraose and neoagarohexaose and other hydrolysis products as D-Galactose, agarotriose and agaropemtaose for neoagarobiose, neoagarotetraose and neoagarohexaose respectively. This mode of action also confirmed it to be a α-NAOS hydrolase. Optimum temperature and pH were 15°C and 7.0 respectively. Km and Vmax values were 1.46mg/ml(4.5mM) and 133.33 μM/min(1.33U/mg). Its activity was severely affected by EDTA at 5mM final concentration. 1mM Mn2+ions increased catalytic activity. Gel permeation chromatography showed it to be a dimer.
The third gene ahg943 is a hypothetical protein from Gayadomonas joobiniege G7. The gene length is 1272 bp and having 423 amino acids. Calculated mol.weight is 47.96k Da. It showed 36% and 40% identity with Saccharophagus degradans 2-40 and Zobellia galactanivorans respectively which are characterized α-NABH. It was cloned in pET28a(+) vector and expressed in E.coli strain ER2566 having N-terminal histag. It has a (1-22 amino acid) signal peptide. Soluble overexpressed protein was purified by TALON resin chromatography. Most of the protein lost in flow through without binding to the resin, may be due to inaccess of His-tag to resin. In order to get maximum protein for characterization studies, soluble protein was treated with 2M urea final concentration. All protein was bound to the resin after 2 M urea treatment. Initial TLC studies showed its weak activity towards neoagarobiose. Neoagarotetraose and neoagarohexaose were completely degraded. One common hydrolysis product L-
AHG was obtained for substrates neoagarobiose, neoagarotetraose and neoagarohexaose and other hydrolysis products as D-Galactose, agarotriose and agaropentaose respectively. This mode of action also confirmed it to be a α-NAOS hydrolase. But the values at A540nm for neoagarobiose as substrate were too less to characterize this protein fully. Gel permeation chromatography showed that Ahg943 to be a monomer, this monomeric form is unique as other reported and characterized α-NABH/NAOS until now are dimer as they have unexpected swapping of the HTH domain which is responsible for the dimerization of enzyme. RB13146 from R. baltica is likely a monomer and may represent an ‘ancestral’ form of the GH117 family which would be limited to the b-propeller, catalytic domain.It is presumed that may be Ahg943 belong to ancestral family of GH117 due monomeric nature. Further protein crystallization studies are required to investigate the catalaytic domain of Ahg943.
Key words: Gayadomonas joobiniege G7, α-NAOS hydrolases
α-Neoagarobiose Hydrolase, Glycoside hydrolase family 117
사지다 아스가
명지대학교 대학원 생명과학정보학과
지도교수 홍순광
해양에서 매우 풍부한 바이오 매스는 홍조류 (Rhodophyta)의 세포벽에서 중요한 구성 성분인 한천이며 주요 갈락탄 탄수화물입니다. 미생물은 해양 바이오 매스의 분해 및 재활용을 위해 분비되는 agarolytic 효소 때문에 전 세계 탄소 순환에서 중요한 역할을 합니다. 가장 잘 알려진 미생물의 agarolytic 경로는 다양한 경우에서 β-(1,4) glycosidic linkages(d-Gal-β(1,4)-AHG)를 파괴하는 β-agarases(EC 3.2.1.81)를 이용한다. 생성된 neoagarooligossaccharides는 α-neoagarobiose(O-3,6-anhydro-alpha-L-galactopyranosyl-(1,3)-D-galactose)를 α-neoagarobiose (NABH) / NAOS 가수 분해 효소로 변환시킴으로써 agarolytic pathway에서 필수적이고 중요한 효소인 fermentable monosaccharides (D-galactose and 3,6-anhydro-L-galactose)로 전환시킵니다.
AOSs, NAOSs, Neoagarobiose (NAB), AHG와 같은 한천의 당류는 항염증제, prebiotics, 미백, 보습 및 항우울증과 같은 다양한 생리 활성을 가지고 있습니다.
Gayadomonas joobiniege G7은 가야 (Gaya) 섬의 연안 해수 시료에서 발견 된 새로운 속 (genus)에 속하는 한천 분해성 해양 박테리아입니다. 이는 그람 음성으로 막대 모양이고 호기성이며 비 운동성 및 색소가 없습니다. 그것은 황화 조류 다당류의 완전한 파괴에 중요한 가수 분해 효소를 암호화하는 많은 유전자를 가지고 있으며 바이오 연료 생산을 위한 바이오 자원으로 간주됩니다. 그래서 본 연구에서 3개의 α-NABH/NAOS 유전자(ahg558, ahg786, ahg943)를 연구했습니다.
Ahg558은 glycosyhydrolase로 유전자 길이가 1080bp이고, 이론적인 mol의 무게는 40.84k Da입니다. 이것은 또한 다른 종의 특징적인 α-NABH / NAOS 유전자와 높은 상동성을 보였습니다. 이런 특징들을 연구하기 위해, 유전자를 pET28a(+) 벡터에 클로닝하고 대장균 ER2566 균주에서 발현시켰습니다. 발현된 단백질은 TALON 레진으로 용해되고 정제했습니다. 이렇게 정제된 단백질은 neoagarobiose, neoagarotetraose 및 neoagarohexaose를 가수 분해 했습니다. 이것은 0.2% 아가로오스에서는 비활성 상태를 유지했습니다. 그리고 neoagrobiose와 함께 밤새 배양하면 D-Galactose와 3,6 AHG가 생성됩니다. 그것은 또한 3,6 AHG와 agarotriose와 neoagarohexaose를 생산하는 neoagarotetraose를 분해시켰으며 3,6 AHG와 agaropentaose를 생성하는 것으로 보아 exo-acting alpha-neoagarobiose hydrolase임을 확인했습니다. pH 9.0 (Glycine-NaOH) 및 30 ℃의 알칼리성 범위에서 최대 활성을 보였습니다. 겔 침투 크로마토그래피는 이를 2량체로 나타냈고, Km 및 Vmax 값은 각각 2.6mg/ml 및 2x103μM/min이었습니다. 금속 이온 효과를 위해 처리 하였을 때는 1mM Mn2?이온에 대해 161%의 활성을 보였고, EDTA는 최종 농도 0.5mM 및 5Mm에서 효소 활성에 강하게 영향을 미쳤습니다.
두 번째 유전자 인 ahg786은 Gayadomonas joobiniege G7 게놈 데이터에서 보고되었으며, glycosyl hydrolase로 해석이 되었습니다. 다른 종의 특징적인 α-NABH / NAOS 유전자와 높은 상동성을 보였고, 그것은 pET28a(+) 벡터에 클로닝하여 N-말단에 his-tag를 갖는 대장균 균주 로제타 가미 (Rosetta gami)에서 발현시켰습니다. 그것에는 (1-25 아미노산) 신호 펩티드가 있습니다. 과발현된 수용성 단백질은 TALON 레진 크로마토그래피로 정제하였습니다.
neoagarobiose, neoagarotetraose 및 neoagarohexaose와 D-Galactose, agarotriose 및 agaropemtaose등의 다른 가수 분해 생성물은 모두 공통적으로 가수 분해 생성물 3,6 AHG를 생산했습니다. 또한 이 작용 방식으로 그것이 α-NABH/NAOS 가수 분해 효소임을 확인했습니다. 최적 온도와 pH는 각각 15 ℃와 7.0이고, Km 및 Vmax 값은 1.46mg/ml 및 133.33μM/min입니다. 그 활성은 최종 농도 5mM에서 EDTA에 의해 강력하게 영향을 받았고, 1mM Mn2?이온은 촉매 활성을 증가시켰습니다. 겔 침투 크로마토그래피는 이것을 2량체로 나타냈습니다.
세 번째 유전자 ahg943은 Gayadomonas joobiniege G7의 가설적인 단백질입니다. 유전자의 길이는 1272bp이고 423개의 아미노산을 가지고 있고, mol의 무게는 47.96kDa입니다. Saccharophagus degradans 2-40 및 Zobellia galactanivorans와 각각 36% 및 40%의 동일성을 보였으며, 각각 α-NABH를 가지는 특징을 보였습니다. 이를 pET28a(+) 벡터에 클로닝시키고, N-말단에 his-tag를 갖는 E.coli 균주 ER2566에서 발현시켰습니다. 그것은 (1-22 아미노산) 신호 펩타이드를 가지고 있고, 과발현된 수용성 단백질은 TALON resin 크로마토그래피로 정제하였습니다. 레진에 결합하지 않고 흘러 손실된 대부분의 단백질은 레진에 histag가 없어서 발생할 수 있습니다. 특성화 연구를 통해 최대 단백질을 얻기 위해, 수용성 단백질을 최종 농도 2M urea로 처리하였습니다. 모든 단백질들은 2M의 urea를 처리 한 후에 레진에 결합한다. 초기 TLC에서는 가수 분해된 기질이 보여지는 것처럼 neoagarobiose에 대한 약한 활성을 보였습니다. 그러나 neoagarotetraose와 neoagarohexaose에 대해서는 완전한 분해가 나타납니다.
Neoagarobiose, Neoagarotetraose 및 Neoagarohexaose와 D-Galactose, agarotriose 및 agaropentaose와 같은 다른 가수 분해 생성물은 모두 공통적으로 가수 분해 생성물 3,6 AHG를 생산했습니다. 이로써 그것이 α-NABH / NAOS 가수 분해 효소임을 확인할 수 있었고, 최적 온도 및 pH는 각각 30 ℃ 및 6.0이었습니다. 그러나 이 단백질의 특성을 평가하기에는 값이 너무 작았습니다. 아마도 이 단백질은 특성화된 단백질이 가지는 다양한 아미노산 서열이 일부 아미노산 잔기에서 다른 점을 보이기 때문에 약한 단백질일수 있습니다.
Key words: Gayadomonas joobiniege G7, 알파네오아가로바이오스 하이드롤레이즈, Glycoside hydrolase family 117
Biochemical characterization of alpha-neoagarooligosaccharide hydrolases from Gayadomonas joobiniege G7
Sajida Asghar
Graduate School, Myongji University
Department of Biological Sciences
Advisor Hong Soon-Kwang
The highly abundant biomass in ocean is agar, major constituent in the cell wall of red algae (Rhodophyta) and is main galactan carbohydrate. Microorganisms play an important role in global carbon cycle because of agrolytic enzymes which they secrete for degradation and recycling of marine biomass. The most well-known microbial agarolytic pathway utilizes β-agarases (EC 3.2.1.81) which break β-(1,4) glycosidic linkages (D-Gal-β(1,4)-AHG) in various modes. The resulting neoagarooligossaccharides are degraded by α-neoagarobiose (NABH)/NAOS hydrolase, which is an essential and crucial enzyme in agarolytic pathway as it converts α-neoagarobiose (O-3,6-anhydro-alpha-L-galactopyranosyl-(1,3)-D-galactose) into fermentable monosaccharides (D-galactose and 3,6-anhydro-L-galactose).
Gayadomonas joobiniege G7 is an agar-degrading marine bacterium belonging to a novel genus identified from coastal sea water sample from Gaya Island, Korea. It is Gram-negative, rod shaped, aerobic, non-motile, and non-pigmented. It has many genes encoding hydrolytic enzymes important for complete breakdown of sulfated algal polysaccharides, and considered as a bioresource for biofuel production. The current study has focused three α-NAOS genes (ahg558, ahg786, ahg943) which belongs to GH 117 family.
Ahg558 is a glycosyhydrolase, having gene length of 1080bp. Theoretical mol.we-
ight is 40.84k Da. It showed high homology with characterized α-NABH/NAOS genes from other species. For the characterization studies, the gene was cloned in pET28a(+) vector and expressed in E.coli strain ER2566. The expressed protein was soluble and purified by TALON-resin. The purified protein hydrolyzed neoagarobiose, neoagarotetraose and neoagarohexaose. It remained non-active on 0.2%agarose. It produced D-Galactose and L-AHG when incubated overnight with neoagrobiose. It also degraded neoagarotetraose producing L-AHG and agarotriose and neoagarohexaose and produced L-AHG and agaropentaose confirming it to be an exo-acting α-NAOS hydrolase. It showed maximum activity in alkaline range in pH 9.0 and at 30°C. Gel permeation chromatography showed it to be a dimer. Km and Vmax values were 2.6 mg/ml (8.01mM) and 2x103 μM/min (133.33U/mg) respectively. When treated for metal ions effect, it showed 161% of activity for 1mM Mn2+ions. EDTA strongly affected the enzyme activity at 0.5mM and 5mM final concentration.
The second gene ahg786 was reported from Gayadomonas joobiniege G7 genomic data and annotated as a putative glycosyl hydrolase. It showed high homology with characterized α-NABH/NAOS genes from other species. It was cloned in pET28a(+) vector and expressed in E.coli strain Rosetta gami having N-terminal histag. It has a (1-25 amino acid) signal peptide. Soluble overexpressed protein was purified by TALON resin chromatography. One common hydrolysis product L-AHG was obtained for substrates neoagarobiose, neoagarotetraose and neoagarohexaose and other hydrolysis products as D-Galactose, agarotriose and agaropemtaose for neoagarobiose, neoagarotetraose and neoagarohexaose respectively. This mode of action also confirmed it to be a α-NAOS hydrolase. Optimum temperature and pH were 15°C and 7.0 respectively. Km and Vmax values were 1.46mg/ml(4.5mM) and 133.33 μM/min(1.33U/mg). Its activity was severely affected by EDTA at 5mM final concentration. 1mM Mn2+ions increased catalytic activity. Gel permeation chromatography showed it to be a dimer.
The third gene ahg943 is a hypothetical protein from Gayadomonas joobiniege G7. The gene length is 1272 bp and having 423 amino acids. Calculated mol.weight is 47.96k Da. It showed 36% and 40% identity with Saccharophagus degradans 2-40 and Zobellia galactanivorans respectively which are characterized α-NABH. It was cloned in pET28a(+) vector and expressed in E.coli strain ER2566 having N-terminal histag. It has a (1-22 amino acid) signal peptide. Soluble overexpressed protein was purified by TALON resin chromatography. Most of the protein lost in flow through without binding to the resin, may be due to inaccess of His-tag to resin. In order to get maximum protein for characterization studies, soluble protein was treated with 2M urea final concentration. All protein was bound to the resin after 2 M urea treatment. Initial TLC studies showed its weak activity towards neoagarobiose. Neoagarotetraose and neoagarohexaose were completely degraded. One common hydrolysis product L-
AHG was obtained for substrates neoagarobiose, neoagarotetraose and neoagarohexaose and other hydrolysis products as D-Galactose, agarotriose and agaropentaose respectively. This mode of action also confirmed it to be a α-NAOS hydrolase. But the values at A540nm for neoagarobiose as substrate were too less to characterize this protein fully. Gel permeation chromatography showed that Ahg943 to be a monomer, this monomeric form is unique as other reported and characterized α-NABH/NAOS until now are dimer as they have unexpected swapping of the HTH domain which is responsible for the dimerization of enzyme. RB13146 from R. baltica is likely a monomer and may represent an ‘ancestral’ form of the GH117 family which would be limited to the b-propeller, catalytic domain.It is presumed that may be Ahg943 belong to ancestral family of GH117 due monomeric nature. Further protein crystallization studies are required to investigate the catalaytic domain of Ahg943.
Key words: Gayadomonas joobiniege G7, α-NAOS hydrolases
α-Neoagarobiose Hydrolase, Glycoside hydrolase family 117
목차
- Table of ContentsList of Figures iList of Tables ivList of Abbreviations vEnglish Abstract viiChapter 1 Introduction1.1 Algal biomass 11.2 Agar and agarose 21.3 Agarolytic microorganisms 41.4 Agarases 41.5 α-agarolytic pathway of agarose degradation 61.6 β-agarolytic pathway of agarose degradation 61.7 GH117 enzymes are exo-acting α-agarases 91.8 Types of α-NABH 111.9 Uses of agarases 141.10 Importance of L-AHG, a rare anhydro sugar 141.11 Gayadomonas joobiniege G7 strain 151.12 Research objective 191.13 References 20Chapter 2 Materials and methods2.1 Bacterial strains and plasmids 302.1.1 E.coli strains 302.1.2 Plasmid 302.1.3 Antibiotic concentrations for E.coli strains 302.1.4 Buffer used for his-tagged protein purification 302.2 Genomic DNA 322.3 Isolation of genomic DNA from Gayadomonas joobiniege G7 322.4 Preparation of competent cells 332.5 Growth conditions of E.coli strains with transformed vector 332.6 PCR conditions 332.7 Protein purification 342.8 Protein concentration by Bradford method 342.9 Protein analysis 342.10 Determination of enzyme activity by DNS Method 342.11 Determination of molecular mass of α-NAOS hydrolases by gel filtration chromatography 352.12 Enzymes and chemicals 352.13 References 36Chapter 3 Biochemical characterization of alkaline exo-acting α-neoagarooligosaccharide hydrolase Ahg558 from novel species Gayadomonas joobiniege G73.1 Ahg558 373.2 Construction of recombinant plasmid vector for expression of Ahg558 in E.coli ER2566 393.3 Transforamtion of recombinant vector (pET28a+-ahg558) 393.4 Expression of Ahg558 in E.coli ER2566 393.5 Protein purification 403.6 Determination of enzyme activity by DNS method 403.7 Thin layer chromatography analysis of hydrolyzed products by Ahg558 403.8 Enzyme characterization of Ahg558 453.8.1 General properties 453.8.2 Enzyme Kinetics 493.8.3 Mode of Action 503.9 Discussion 553.10 Summary 593.11 References 60Chapter 4 Identification and biochemical characterization of a novel cold adapted 1,3-α-3,6-anhydro-L-galactosidase, Ahg786, from Gayadomonas joobiniege G74.1 Ahg786 644.2 Construction of recombinant plasmid vector for expression of Ahg786 in E.coli Rosetta gami 664.3 Transforamtion of recombinant vector (pET28a(+)-ahg786) 664.4 Expression of Ahg786 in E.coli Rosetta gami 664.5 Protein purification 674.6 Determination of enzyme activity by DNS method 674.7 Thin layer chromatography analysis of hydrolyzed products byAhg786 674.8 Enzyme characterization of Ahg786 724.8.1 General properties 724.8.2 Enzyme Kinetics 774.8.3 Mode of Action 784.9 Discussion 834.10 Summary 864.11 References 87Chapter 5 Identification of a unique monomeric α-NAOS hydrolase fromnovel species Gayadomonas joobiniege G75.1 Ahg943 895.2 Construction of recombinant plasmid for expression of Ahg943 in E.coli ER2566 915.3 Transforamtion of recombinant vector (pET28a(+)-ahg943) 915.4 Expression of Ahg943 in ER2566 915.5 Protein purification 925.6 Determination of enzyme activity by DNS method 925.7 Thin layer chromatography analysis of hydrolyzed products by Ahg943 935.8 Enzyme characterization of Ahg943 985.81 General properties 985.8.2 Mode of action 995.9 Discussion 1045.10 Summary 1075.11 References 108Korean Abstract 110
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