Identification of Off Target of CT-P22, Anti-Influenza Antibody, and Its Risk Assessment :

전황근,  Jun, Hwangkeun

학위논문

저자정보: 전황근 ; Jun, Hwangkeun (인하대학교, 인하대학교 대학원)

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독감은 계절성 유행병으로 전 세계적으로 확산되어 매년 수십만 명의 생명을 빼앗고 있으며, 대유행이 발생할 때는 수백만 명의 사망을 불러일으키고 있다.
현재 독감 치료를 위해 뉴라미니데이즈 저해제 및 M2 단백질 저해제들와 같은 항바이러스 제제들이 상용하되어 사용되고 있으나, 이들 약에 대한 내성 변이 독감 바이러스들이 계속 보고되고 있어, 새로운 약물 개발이 강하게 요구되었다. 이에 인플루엔자 바이러스 내 변이가 적은 부위인 HA2 부위를 표적으로 하는 인간 IgG 단클론 항체 CT-P22와 CT-P23 동일비율로 구성된 CT-P27이 독감치료제로 개발되었다.
본 연구에서, 나는 건강한 피험인을 대상으로 하는 임상1상을 지원하기 위해 CT-P22, CT-P23 그리고/또는 CT-P27의 독성을 밝히기 위한 비임상시험을 수행하였다.
독성 연구 수행전에 면역 조직 화학 염색 방법을 개발 및 검증하고, 이와 같이 검증된 방법을 이용하여 독성평가에 적절한 동물종 선별을 위해 인간, 원숭이 및 다양한 동물들의 조직을 대상으로 조직 교차 반응성 연구를 진행하였다. 시험결과 비록 CT-P23은 인간과 원숭이 조직에 대해 반응성을 보이지 않았으나, CT-P27의 또 하나의 구성 성분인 CT-P22가 인간 및 비인간 영장류인 원숭이 일부 조직에서 유사한 조직 교차 반응을 보여, 해당 시험 결과를 바탕으로 비인간 영장류인 필리핀 원숭이 (cynomolgus monkey)를 CT-P27의 독성 평가를 위한 가장 적합한 동물모델로 선정하여 2주 반복 투여 독성시험을 수행하였다. 독성시험에서CT-P27을 고용량으로 정맥 내 주입 (infusion)한 상황에서도 필리핀 원숭이는 잘 견디었지만 일부 개체에서 경련 증상과 조직병리검사에서 신경교증이 동시에 관찰되었다.
이에 조직교차반응 결과와 동물에서 발견된 현상들이 비표적 단백질과의 반응에 의한 부작용을 유도할 가능성이 있는지 파악하기 위해 몇가지 추적 연구를 수행하였다. 먼저 시험 물질이 투여되지 않았던 원숭이들에서의 경련 또는 이와 유사한 증상 및 신경교증에 대한 역대 발병율 조사와 조직 교차 반응성 시험에서의 염색결과에 대한 추가적인 조직학적 평가를 하였다. 그 결과 약물투여와 시험 중 나타난 신경계 관련 부작용간 연관성이 낮을 것이라고 예측할 수 있었다. 이 후 질량분석법에 근거한 프로케오믹스 분석법을 이용하여 CT-P22가 어떤 단백질과 결합반응을 갖는지 그리고 그 반응이 변성되지 않은 단백질과 약리학적으로 의미있는 결합을 갖는지 확인하고자 하였다.
이러한 연구 결과, CT-P22과 결합 하는 단백질들은 세포질에 현저하게 국한되게 위치하고 있어 CT-P22가 생체내에서 만날 수 없는 단백질이고, 또한 CT-P22와의 결합도 생체내 온전한 상태가 아닌 주로 생체 활성을 잃은 변성된 상태의 단백질과의 결합임을 확인 함으로써, 필리핀 원숭이 일부 개체에서 관찰된 경련과 신경교증은 약물투약과의 연관성이 없다는 것을 밝힐 수 있었다. 이 연구 결과는 또한 건강한 지원자에게 투여 한 임상 시험에서 어떠한 부작용도 보고되지 않았다는 것으로부터 그리고 또한 독감 환자를 대상으로 한 CT-P27에 대한 임상 시험이 아무 부작용없이 현재 진행되고 있다는 사실로부터도 지지 받을 수 있다. 이러한 나의 연구는 면역조직염색에서 보인 항체에 대한 비표적 단백질의 반응이 변성된 단백질에 의한 것이라는 것과 이러한 비표적 단백질을 파악하는데 생체외 프로테오믹스를 이용한 접근법이 효과적이라는 것을 입증하는데 도움이 되었다.

Influenza spreads around the world in seasonal epidemics, resulting in the deaths of hundreds of thousands people every year and millions of people in some pandemic years.
Although there are several commercially available anti-influenza drugs such as Neuraminidase inhibitors and M2 protein inhibitors, there is a strong unmet need for novel therapeutics due to appearance of drug resistant influenza viruses. CT-P27 is a novel anti-influenza therapeutics contains two recombinant human IgG1 monoclonal antibodies, CT-P22 and CT-P23, in 1:1 (w:w) ratio.
In this study, I conducted the nonclinical program for CT-P27 to elucidate the toxicology of CT-P22, CT-P23, and/or CT-P27 for support of clinical phase I trials in healthy volunteers.
Prior to toxicity study in animals, tissue cross reactivity (TCR) studies were conducted in human, monkey and several other species with the validated methods to identify the relevant animal for toxicology study. On the basis of the tissue cross reactivity study results, the non-human primate, cynomolgus monkey, was selected for the most representative model of potential CT-P27 toxicity since CT-P22 exhibited similar tissue cross reactivity in some human and non-human primate tissues although CT-P23 did not exhibit cross reactivity to any human or non-human primate tissue tested. In 2-week repeat dose toxicity study, administration of CT-P27 to cynomolgus monkeys at high dose levels by intravenous infusion was well tolerated. However, twitching and multiple foci of gliosis in the brain were observed in certain animals during the toxicity study.
Several investigational studies were preformed to evaluate whether the TCR result and observations in animal could lead to off-target effects and toxicity. Firstly, the literature survey on the historical control incidence of twitching, and gliosis in cynomolgus monkeys as well as further pathological evaluation on tissue cross reactivity staining results were conducted. Those investigation results suggested a weak correlation between drug candidate and its side effects. Secondly, in vitro mass-based protemics analysis was applied to determine the off-target proteins of CT-P22 and whether CT-P22 can bind to non-denatured human antigens at potentially pharmacologically relevant affinities.
As the result of investigational studies, the occurrence of twitching and gliosis in cynomolgus monkeys is not thought to treatment related because the binding of CT-P22 with off-target protein is unlikely to be relevant in vivo since all of the potential off-target proteins are prominently localized in the cytosol where CT-P22 antibody is unlikely to penetrate cells in vivo and its binding is mainly to the denatured form of off-target protein rather than the native form. This conclusion of the investigational studies was further supported by the subsequent clinical trials in which CT-P27 was administrated to healthy volunteers and there was no adverse effect reported. In addition, the clinical phase 2 studies for CT-P27 in flu patients are in progress without any adverse effect. My work has helped demonstrate that off-target reactivity to antibody in immunohistochemical staining can be originated from the denatured protein and that in vitro proteomic approach can be an effective way of elucidating off-target to antibody.

#off target #anti-influenza #antibody #influenza

요 약 (I)
ABSTRACT (IV)
CONTENTS (VI)
LIST OF TABLES (X)
CAPTIONS FOR FIGURES (XI)
CHAPTER I (1)
INTRODUCTION (1)
1.1. Influenza (Flu) (2)
1.2. Influenza Virus (2)
1.3. Theraputics against Influenza (5)
1.4. CT-P27 Development (6)
1.5. CT-P27 Nonclinical Study (10)
CHAPTER II (12)
MATERIALS AND METHODS (12)
2.1. Tissue Cross Reactivity Studies (13)
2.1.1. Validation of Immunohistochemical Staining Methods for the Demonstration of Staining with CT-P22 (13)
2.1.2. Validation of Immunohistochemical Staining Methods for the Demonstration of Staining with CT-P23 (17)
2.1.3. Assessment of the Potential Cross Reactivity of CT-P22 with a Full Panel of Human Tissues (22)
2.1.4. Assessment of the Potential Cross Reactivity of CT-P22 with a Full Panel of Cynomolgus Monkey Tissues (25)
2.1.5. Assessment of the Potential Cross Reactivity of CT-P23 with a Full Panel of Human Tissues (29)
2.1.6. Assessment of the Potential Cross Reactivity of CT-P23 with a Full Panel of Monkey Tissues (32)
2.1.7. Assessment of the Potential Cross Reactivity of CT-P22 with a Selected Panel of Human, Cynomolgus Monkey, Rhesus Monkey, Marmoset, Dog, Guinea Pig, Rabbit, Rat and Mouse Tissues (36)
2.2. 2-Week Repeat-dose Toxicity Study in Monkeys with CT-P27 (40)
2.2.1. Materials (40)
2.2.2. Vehicle and Test Article Preparation (40)
2.2.3. Analysis of Dosing Formulations (41)
2.2.4. Experimental Design (41)
2.2.5. Test Article Administration (44)
2.2.6. In-life Examinations (45)
2.2.7. Postmortem Study Evaluations (51)
2.2.8. Statistics (52)
2.3. Further Pathological Evaluation (57)
2.4. Identification of Off-target Proteins (57)
2.4.1. Tissue lysis, Immunoprecipitation and Western blotting (60)
2.4.2. Mass Spectrometry (62)
2.4.3. Western Blotting of Recombinant Proteins Corresponding to the Potential Off-target Proteins (64)
CHAPTER III (66)
RESULTS AND DISCUSSION (66)
3.1. Tissue Cross Reactivity Studies (67)
3.1.1. Validation of Immunohistochemical Staining Methods for the Demonstration of Staining with CT-P22 (67)
3.1.2. Validation of Immunohistochemical Staining Methods for the Demonstration of Staining with CT-P23 (72)
3.1.3. Assessment of the Potential Cross Reactivity of CT-P22 with a Full Panel of Human Tissues (77)
3.1.4. Assessment of the Potential Cross Reactivity of CT-P22 with a Full Panel of Cynomolgus Monkey Tissues (80)
3.1.5. Assessment of the Potential Cross Reactivity of CT-P23 with a Full Panel of Human Tissues (83)
3.1.6. Assessment of the Potential Cross Reactivity of CT-P23 with a Full Panel of Cynomolgus Monkey Tissues (84)
3.1.7. Assessment of of the Potential Cross Reactivity of CT-P22 with a Selected Panel of Human, Cynomolgus Monkey, Rhesus Monkey, Marmoset, Dog, Guinea Pig, Rabbit, Rat and Mouse Tissues (86)
3.2. 2-Week Repeat-dose Toxicity Study in Monkeys with CT-P27 (92)
3.2.1. Analysis of Dosing Formulations (93)
3.2.2. In-life Examinations (93)
3.2.3. Postmortem Stud Evaluations (103)
3.3. Further Pathological Evaluation (105)
3.4. Identification of Off-target Proteins (111)
3.4.1. Western Blotting of the Lysed and Immunoprecipitated Tissues (111)
3.4.2. Mass Spectrometry (113)
3.4.3. Verification of the CT-P22 Binding Against Potential Off-target Proteins (117)
3.5. Discussion (121)
CHAPTER IV (129)
CONCLUSIONS AND RECOMMENDATIONS (129)
APPENDIX (134)
REFERENCES (147)

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