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(서울대학교, 서울대학교 대학원)

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Salmonella enterica serovar Typhimurium은 전 세계적인 공중 보건 문제 중 하나이다. 이 병원균은 그람 음성, 간균으로서 운동성을 보이는 통성 혐기성 균이다. 전 세계적으로 수백만 명에게서 위장염을 유발하거나 심한 전신 감염을 일으킬 수도 있어 심각한 건강상의 문제를 야기한다. Salmonella Typhimurium은 다양한 병원성 인자와 그 복잡한 조절 기작을 특징으로하는 중요한 식품 매개 병원체로서 연구되어왔다. Salmonella Typhimurium은 세포 내 병원체로서 숙주 세포 내에서 생존하기 위해 다양한 전략을 사용하는 것으로 보고되었다. 박테리아는 PTS라 불리는 phosphotransferase system을 사용하는데, phosphoenolpyruvate(PEP)로부터 유래된 인산기를 하나의 성분으로부터 다른 성분으로 순차적으로 전달한다. Phosphoenolpyruvate: sugar PTS 시스템에서는 PEP의 인산기가 단당류, 이당류, 아미노당류 및 기타 당 유도체와 같은 수많은 공급원으로 전달된다. 또한 PTS는 수많은 유전자 조절 기능을 수행하는 것으로 보고되었다. 많은 Proteobacteria에서 Nitrogen-related PTS(질소대사-PTS)가 발견되고 있다. 이 시스템은 ptsP 유전자가 암호화하는 EINtr, ptsO 유전자가 암호화하는 Npr, 및 ptsN 유전자가 암호화하는 EIIANtr의 세 가지 구성 요소로 이루어진다. ptsO 및 ptsN 유전자가 rpoN 유전자와 동일한 오페론에 위치한다는 이유로 이 시스템이 질소 대사에 관여한다고 제안되었지만, 이 시스템은 질소 대사 이외의 다양한 요소를 조절하는 것으로 보고되고 있다. 또한, 질소대사-PTS에 의해 전달되는 특정 기질이 아직 보고되지 않았으므로, 이 시스템은 주로 박테리아 내 여러 조절 기작을 담당하는 장치로 여겨진다. 선행 연구에서 Salmonella Typhimurium에서 질소대사-PTS의 역할을 이해하기 위해 RNA sequencing을 수행하였고, ptsN이 결핍된 돌연변이 균주와 야생형 간의 전체 transcriptome이 비교 분석된 바 있다. 본 연구에서 ptsN에 의해 조절되는 유전자들을 살펴본 결과, ptsN 돌연변이 균주에서 propionate 대사(prpBCDE)와 관련된 유전자들의 발현이 크게 감소한 것으로 확인되었다. prpBCDE 오페론의 발현 수준이 야생형에 비해 ptsN 돌연변이에서 3배 이상 감소한 것을 확인했다. 메커니즘을 밝히기 위한 실험 결과, 야생형과 ptsN 돌연변이에서 조절자 prpR의 전사 및 번역 수준에는 차이가 없지만 PrpR 단백질의 반감기는 ptsN 돌연변이에서 10배 더 증가하였으므로 PrpR의 번역 후 조절이 ptsN에 의한 것임을 알 수 있었다. Propionate와 같은 short chain fatty acids (SCFAs)는 미생물의 발효 생성물로 생산되며 동물의 장에서 고농도로 존재한다. 이전에 보고된 결과에 의하면 propionyl-CoA는 propionate 대사의 중간체로서 Salmonella pathogenicity island-1 (SPI-1)의 상위조절자인 HilD의 단백질 안정성을 감소시켜 살모넬라 독성의 감소를 유도한다. 이를 바탕으로 본 연구에서는 HilD 안정성이 ptsN 에 의해 조절된다는 것을 확인하였다. 나아가 ptsN 돌연변이 균주의 장 상피세포 침입 능력은 propionate 존재 하에서 야생형의 침입 능력보다 약 2배 높은 것을 확인하였다. 더욱이, EIIANtr 단백질 발현은 propionate 존재 하에서 2배 이상 증가하였다. 본 연구 결과를 통해 EIIANtr이 propionate 대사를 이용하여 Salmonella 생장과 병원성 모두를 조절할 수 있음을 확인하였다. 질소대사-PTS에서 유전자 ptsP에 의해 코딩되는 첫 번째 성분인 EINtr은 phosphoenolpyruvate에 의해 자가 인산화 될 수 있고, Npr과 EIIANtr을 통해 인산기를 전달한다. EIIANtr은 세포 내에서 다양한 조절 메커니즘을 가지는 것으로 보고된 반면, 첫 번째 성분인 EINtr이 어떻게 조절되는지에 대해서는 거의 알려진 바가 없다. 본 연구에서는 EINtr이 Salmonella Typhimurium에서 thioredoxin-1(TrxA)와 직접적인 단백질-단백질 상호 작용을 보인다는 것을 입증하였다. TrxA는 표적 단백질의 이황화물 결합을 변화시킴으로써 모든 살아있는 유기체에서 중요한 세포 내 기능을 수행한다고 알려져 있다. Salmonella Typhimurium에서 TrxA는 질소대사-PTS 의존적으로 kdp 오페론의 발현을 조절한다는 것을 확인했다. EINtr과 TrxA 사이의 단백질 상호 작용은 EINtr의 단백질 안정성에 영향을 미친다. 온전한 TrxA 및 효소적 비활성 형태의 TrxA를 이용하여 실험한 결과, 이 단백질은 촉매 자리인 CXXC 모티프와 독립적으로 EINtr의 안정성을 조절한다는 것을 확인하였다. TrxA에 존재하는 결합 부위를 추정한 뒤, 그 부위를 변화시킨 TrxA 유도체의 기능을 확인한 결과 EINtr과의 단백질-단백질 결합이 사라졌으며, 동시에 EINtr의 안정성과 kdp 오페론의 발현을 조절할 수 있는 능력이 손실되었음을 확인하였다. 이를 통해 TrxA와 EINtr 사이의 특이적 상호 작용은 Kdp 시스템을 조절하는 데 필요하다는 것을 입증하였다. 또한 대식세포 내에서 Salmonella가 생존하기 위해 kdpD, trxA 유전자가 필요하다는 것을 확인하였다. Kdp 시스템은 칼륨의 항상성과 Salmonella의 병원성을 조절하는데 중요하며, 본 연구 결과는 이러한 Kdp 시스템이 어떻게 조절되는지에 대한 메커니즘을 제시하였다. 결론적으로, 본 연구자는 질소대사-PTS가 Salmonella Typhimurium에서 propionate 대사와 칼슘 수송에 대한 새로운 조절 기작을 가지고 있음을 발견했다. PrpBCDE는 Salmonella Typhimurium의 탄소와 에너지 원을 얻기 위해 동물성 장에서 고농도로 존재하는 propionate를 대사하는 효소들이다. 이 연구에서 질소대사-PTS의 한 구성 요소인 EIIANtr은 propionate가 있는 환경에서 동물 세포의 Salmonella 침입을 조절하는 기작을 가지며 이는 prpBCDE 오페론의 발현을 조절함으로써 가능함을 확인하였다. KdpABC는 Salmonella Typhimurium의 생존을 향상시키기 위해 낮은 칼륨 수준 또는 산화성 스트레스하에 칼륨 수송 시스템을 구성하는 효소들이다. 본 연구를 통해 질소대사-PTS가 TrxA의 도움을 받아 kdp 오페론의 발현을 조절한다는 것을 입증했다. 대식세포를 이용한 실험을 통해 kpd 오페론 조절 기작이 Salmonella Typhimurium의 대식세포 내 생존을 위해 필요하다는 것을 확인할 수 있었다. 궁극적으로 Salmonella Typhimurium의 유전자 조절과 병원성에 대한 분자적 수준의 연구는 이 병원균의 병원성을 제어하는 새로운 전략 개발에 도움을 줄 것이며 나아가 Salmonella 관련 질병의 저감화를 위한 기반 연구로 활용될 수 있다.

Salmonella enterica serovar Typhimurium is one of major public health problem worldwide. S. Typhimurium is a rod-shaped, flagellated, facultative anaerobic, and Gram-negative bacterium. It causes health problems from gastroenteritis in millions of people worldwide to severe systemic infection. S. Typhimurium uses a variety of strategies to ensure growth and survival as an intracellular pathogen. The elucidation of complex regulation mechanisms of various virulence factors is crucial to combat this pathogen. Many bacteria employ phosphotransferase system referred to as PTS in which several components transfer phosphoryl groups derived from phosphoenolpyruvate (PEP) from one component to the other in a sequential order for carbohydrate uptake. In phosphoenolpyruvate: sugar PTS, the phosphoryl group of PEP is transferred by this system to numerous sources such as monosaccharides, disaccharides, amino sugars, and other sugar derivatives. The PTS is also involved in a numerous regulatory processes, explaining for the complexity of this system. The nitrogen-related phosphotransferase system (PTSNtr) is found in many Proteobacteria. This system is composed of three components: enzyme INtr (encoded by ptsP), NPr (encoded by ptsO), and enzyme IIANtr (encoded by ptsN). Even though PTSNtr was proposed to be involved in nitrogen metabolism because of the location of ptsO and ptsN downstream of rpoN in the same operon, multiple regulatory functions has been reported besides nitrogen metabolic pathway. Moreover, a specific substrate transferred by PTSNtr has not yet been determined, suggesting that main role of this system is considered a regulatory device. Whole transcriptome analysis of the wild-type and a mutant strain lacking ptsN by RNA sequencing in my lab revealed that expression level of genes (prpBCDE) involved in propionate catabolism was decreased in the ΔptsN mutant strain. I verified that the expression levels of the prpBCDE operon decreased more than 3-folds in the ptsN mutant compared to the wild-type. To elucidate the mechanism of the prp operon regulation by ptsN, I determined transcriptional levels and protein levels of prpR regulator in the wild-type and the ΔptsN mutant. Although there was no difference in transcriptional and translational levels of prpR, the half-life of PrpR protein in the wild-type was 10-fold longer than that in the ΔptsN mutant, indicating post-translational regulation of PrpR by the ptsN gene. The intestinal short chain fatty acids (SCFAs) such as propionate are produced as fermentation products by microbiota and present in high concentrations in the animal intestine. As previously reported, propionyl-CoA, the intermediate of propionate metabolism, reduces the protein stability of HilD, a master regulator of Salmonella pathogenicity island-1 (SPI-1), leading to attenuation in Salmonella virulence. I found that the stability of HilD was increased by the ptsN mutation and that the invasion ability of the ptsN mutant strain was about 2-folds higher than that of wild-type in the presence of propionate. Moreover, EIIANtr protein level was increased by over 2 folds in the presence of propionate. All these results suggest that EIIANt can modulate Salmonella fitness and virulence via propionate catabolism. The first component EINtr encoded by ptsP can be autophosphorylated by phosphoenolpyruvate and transfers a phosphate group over Npr to EIIANtr. While EIIANtr has been reported to have various regulations in cellular processes, little is known about how the first component EINtr is regulated. In this work, I demonstrated that EINtr showed direct protein-protein interaction with thioredoxin-1 (TrxA) in S. Typhimurium using a bacterial two-hybrid system and GST pull-down assay. TrxA, which is encoded by trxA, carries out a number of important cellular functions in all living organisms. I found that TrxA regulate the expression of the kdp operon in a PTSNtr-dependent manner in S. Typhimurium. The interaction between EINtr and TrxA affect the stability of EINtr. Complementation analysis using intact TrxA and catalytically inactive form showed that this small protein regulates the stability of EINtr independently of its catalytic site, a CXXC motif. The specific interaction between TrxA and EINtr is required for regulating the Kdp system, as evidenced by the finding that mutation of the putative binding site on TrxA abolished the ability to modulate both the stability of EINtr and the expression of kdp operon. Moreover, I also found that kdpD and trxA genes are required for Salmonella survival in macrophage. These findings suggest how interaction between EINtr and TrxA adjusts the Kdp system which is important for regulating potassium homeostasis and Salmonella virulence. In conclusion, it was discovered that the PTSNtr has new regulation mechanisms on propionate catabolism and potassium uptake in S. Typhimurium. Products of prpBCDE are enzymes catalyzing propionate present in high concentrations in animal intestine to acquire carbon and energy source for S. Typhimurium. In this study, EIIANtr, one components of nitrogen-related PTS, controlled the expression of the prpBCDE operon in response to the environmental cue modulating Salmonella invasion into animal cells in the presence of propionate. The kdpABC constitute potassium transport system under the low potassium level or oxidative stress to increase survival of S. Typhimurium. This study also demonstrated that the PTSNtr is required for regulating the expression of kdp operon with the aid of TrxA. This regulation contributes to intracellular survival of S. Typhimurium in macrophage. Ultimately, understanding the regulation mechanisms of genes involved in pathogenesis of S. Typhimurium by molecular analysis would be helpful for the development of a new strategy to control S. Typhimurium pathogenesis and reduce diseases caused by Salmonella.
#Salmonella Typhimurium #Nitrogen-related phosphotransferase system #Propionate catabolism #Thioredoxin-1 #Kdp system #Salmonella pathogenicity

목차

  1. Contents
    Abstract 1
    Contents 6
    List of Figures 11
    List of Tables 15
    I. Introduction 16
    I.1. Salmonella enterica serovar Typhimurium 16
    I.2. Pathogenesis of S. Typhimurium, virulence factors and their regulations 19
    I.2.1. Salmonella pathogenicity island-1 (SPI-1) 20
    I.2.2. Salmonella pathogenicity island-2 (SPI-2) 21
    I.3. Nitrogen-related phosphotransferase system 25
    I.4. Objectives of this research 28
    II. EIIANtr is Required for Propionate Catabolism Leading to the Regulation of Salmonella Invasion 30
    II.1. Introduction 31
    II.2. Materials and Methods 38
    II.2.1. Bacterial strains and growth conditions 38
    II.2.2. Construction of strains 44
    II.2.3. Construction of plasmids 50
    II.2.4. Data analysis of RNA-sequencing results 52
    II.2.5. Heat map generation 52
    II.2.6. RNA extraction 52
    II.2.7. Quantitative real-time PCR 53
    II.2.8. β-galactosidase assay 56
    II.2.9. Western blot analysis 57
    II.2.10. Analysis of protein stability 57
    II.2.11. Gentamicin protection assay 58
    II.2.12. Growth curve measurements 59
    II.3. Results 60
    II.3.1. RNA-sequencing analysis revealed modulation of genes involved in propionate metabolism by ptsN 60
    II.3.2. EIIANtr stimulates expression of genes involved in propionate catabolism operon (prpBCDE) 63
    II.3.3. EIIANtr controls propionate catabolic pathways in a pdu-independent manner 65
    II.3.4. Stability of regulator PrpR are down-regulated by ptsN 69
    II.3.5. Salmonella invasion is affected by propionate metabolism 77
    II.3.6. The negative effect of ptsN on SPI-1 is mediated by HilD post-translationally 81
    II.3.7. EIIANtr production increases in response to propionyl-CoA 86
    II.4. Discussion 94
    III. Thioredoxin-1 Controls Potassium Uptake System Required for Intracellular Survival of Salmonella via Direct Interaction with Enzyme INtr 100
    III.1. Introduction 101
    III.2. Materials and Methods 106
    III.2.1. Bacterial strains and growth conditions 106
    III.2.2. Construction of strains 114
    III.2.3. Construction of plasmids 118
    III.2.4. Point mutation using overlap-PCR 126
    III.2.5. Gibson assembly 127
    III.2.6. Bacterial two-hybrid assay to determine protein-protein interactions 127
    III.2.7. β-galactosidase assay 128
    III.2.8. In vitro GST pull-down assay 128
    III.2.9. Fluorescence analysis 129
    III.2.10. Expression and purification of his-tagged TrxA and EINtr 130
    III.2.11. In vitro redox state determination 131
    III.2.12. RNA extraction and quantitative real-time PCR 133
    III.2.13. Analysis of EINtr stability 136
    III.2.14. Western blot analysis of TrxA 136
    III.2.15. Bacterial viability against hydrogen peroxide 137
    III.2.16. Gentamicin protection assay 138
    III.3. Results 140
    III.3.1. Screening of protein-protein interaction associated with components of PTSNtr 140
    III.3.2. TrxA shows specific protein-protein interaction with EINtr 143
    III.3.3. TrxA influences the expression level of kdp operon via PTSNtr 149
    III.3.4. Direct interaction between TrxA and EINtr affects the expression of kdp operon 156
    III.3.5. The CXXC motif of TrxA is not required for the expression of kdp operon 162
    III.3.6. TrxA exerts redox state exchange with EINtr in vitro 166
    III.3.7. TrxA decreases the stability of EINtr 172
    III.3.8. Interaction between TrxA and EINtr contributes to the degradation of EINtr 178
    III.3.9. Lon protease is responsible for the degradation of EINtr protein 180
    III.3.10. TrxA and EINtr contributes to intracellular survival of S. Typhimurium 184
    III.4. Discussion 189
    References 199
    국문 초록 227

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