Functional characterization of PFN1 and its specific regulation in DNA damage response and repair machinery :인간 피부 표피세포에서 PFN1 기능 및 DNA 손상 반응 및 복구 시스템 조절 규명

이창진

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자료유형: 학위논문

저자정보: 이창진 (차의과학대학교, 차의과학대학교 대학원)

지도교수: 강윤정

발행연도: 2019

저작권: 차의과학대학교 논문은 저작권에 의해 보호받습니다.

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초록· 키워드

피부는 자외선 (Ultraviolet radiation)이나 화학 물질과 같은 외부환경으로부터 보호하는 일차적 방어막 역할을 하는 기관이다. 피부 표피에 존재하는 피부 표피세포 (Keratinocyte)는 DNA 손상에 노출되어 다양한 변화를 겪으며, 만약 DNA 손상이 복구되지 않을 시 피부에 치명적인 효과를 불러일으킨다.
Profilin-1 (PFN1) 은 12-14kDa의 작은 단백질로 단량체 액틴 (G-actin)에 결합하여 액틴 중합반응 (Actin polymerization) 과 세포골격 (Cytoskeleton) 형성에 관여한다. PFN1은 세포의 유지와 성장에 필수적인 역할을 함에도 불구하고, 피부 표피세포에서의 분자적 기능은 아직 연구가 부족하다. 따라서, 본 연구에서는 인간 피부 표피 세포에서의 PFN1의 기능을 밝히고 DNA 손상 반응 (DNA damage response)과 DNA 복구 기작 (DNA repair)에서의 역할을 규명하였다.
인간 피부 세포주 중 하나인 HaCaT 세포에서 PFN1 발현양을 특이적으로 억제하였을 시 현저하게 섬유상 액틴 (F-actin) 형성이 감소된 것을 관찰하였고 이는 PFN1 유전자가 인간 피부 표피세포에서 세포 유지에 중요한 역할을 한다는 것을 의미한다. PFN1 유전자 발현 억제 (Knockdown)에 의한 액틴 골격 붕괴는 세포와 세포 접촉면에서 섬유상 액틴의 휘감는 케이블 구조 (Circumferential cable formation of F-actin) 감소와 세포 접착 (Cell adhesion)에 관여하는 E-cadherin과 EpCAM의 형성 감소를 유도하였다. PFN1 유전자 발현 억제는 세포 부착에 관여하는 vinculin의 동원과 발현을 감소시키는 반면에 PFN1 유전자 과발현 (Overexpression)은 vinculin의 동원을 증가시켰다. 이 결과는 PFN1이 세포 부착 (Focal adhesion)에 중요한 역할을 한다는 것을 가리킨다.
PFN1 발현 억제 유도된 피부 표피 세포에 DNA 손상을 유도하였을 때 세포사 (Apoptosis) 가 증가하였고 DNA 손상을 유도하였을 시 피부 표피 세포에서 세포질에 존재하던 PFN1이 핵 안으로 이동하고 회복시간동안 다시 세포질로 복귀하는 것을 관찰하였다. PFN1 유전자가 특이적으로 억제된 피부 표피 세포에서 PTEN 인산화에 의한 PTEN의 비활성화가 유도되었고 그에 따른 AKT의 Ser473 인산화 증가를 동반하였다. PFN1 발현 억제된 HaCaT 세포에서 자외선과 doxorubicin을 이용한 DNA 손상 유도 후 γH2AX가 DNA 손상 부위에 모집되지만 DNA 복구 작업에 참여하는 53BP1, FANCD2, RAD50, p53 유전자의 발현 유도에 실패하였다. 반면 대조군에서는 DNA 손상 후 위 유전자들이 확연하게 발현이 유도되었다. 또한 PFN1 발현 억제된 HaCaT 세포에서는 자외선과 doxorubicin에 의한 DNA 손상 후 PTEN-AKT 신호전달이 유도되지 않았으며 회복 기간 뒤 γH2AX 축적과 함께 CHK1에 의한 세포 주기 억제 (Cell cycle arrest)가 복구되지 않았다.
본 연구에서는 DNA 손상 반응과 DNA 복구 과정에서의 PFN1 기능을 규명하였고 이는 외인성 DNA 손상 인자에 의한 피부 보호에 관여할 것으로 기대되어 진다. PFN1에 의한 PTEN 관련 DNA 손상 감지 및 복구 경로 선택의 조절을 다루는 향후 연구는 피부 노화와 암에 대한 새로운 치료 타겟 또는 치료 방법을 발견하는데 도움이 될 수 있다.

핵심어 : Profilin-1, 피부 표피 세포, 세포 골격 형성, DNA 손상 반응, DNA 복구

Skin is a primary barrier to detrimental circumstance such as UV and chemical attack. Skin cells, especially keratinocytes in the epidermis, undergo dynamic changes upon DNA damages, and if unrepaired, it can be lethal leading to malignant transformation. Profilin-1 (PFN1) is a small protein (12-14kDa) that regulates actin polymerization and cytoskeletal growth by binding to globular actin (G-actin). Despite the essential roles of PFN1 in cell integration, growth, and cell-cell adhesion, its subcellular function in keratinocyte has not been widely studied yet. In this study, we firstly characterize the functional roles of PFN1, and its specific regulation in DNA damage response and repair machinery in human keratinocyte, HaCaT cells. Depletion of PFN1 significantly reduces filamentous actin formation suggesting its important role in cellular integrity. Actin cytoskeleton disruption induced by PFN1 knockdown diminished the circumferential cable formation of F-actin and also failed to localize adhesion-associated proteins such as E-cadherin and EpCAM at the sites of cell-cell contact in HaCaT cells. In addition, PFN1 knockdown decreased vinculin recruitment and its expression, whereas vinculin foci formation was increased with PFN1 overexpression indicating a crucial role of PFN1 in focal adhesion. Moreover, PFN1 depletion accelerated DNA damage-mediated apoptosis inducing the alterations of predominant cytoplasmic localization of PFN1 to the nucleus and subsequent restoration of cytoplasmic PFN1 during the recovery time. PFN1-depleted HaCaT cells exhibited PTEN loss of function instigated by increased phosphorylated inactivation followed by high levels of AKT activation at Ser473 residue. Even though γH2AX was recruited at the sites of DNA double strand breaks in response to doxorubicin or UVB-induced DNA damage, it failed to induce DNA repair factors including 53BP1, FANCD2, RAD50, TP53 in PFN1-depleted HaCaT cells, whereas control cells exhibited significant increases of these genes. In addition, after DNA damages by Doxorubicin and UVB, PTEN-AKT cascade was not induced in PFN1 depleted HaCaT and CHK1-mediated cell cycle arrest was not recovered even after the recovery time exhibiting γH2AX accumulation. This might suggest the role of PFN1 in regulating DNA damage response and repair machinery to protect the skin from extrinsically induced DNA damage. Future studies addressing the crosstalk and regulation of PTEN-related DNA damage sensing and repair pathway choice by PFN1 may further aid to identify new therapeutic targets of therapeutic intervention for skin aging and cancer

#Profilin-1 #keratinocyte #cytoskeletal organization #DNA damage response #DNA repair

Ⅰ. INTRODUCTION 1
I-1. DNA damages in skin 1
I-2. PFN1 6
Ⅱ. MATERIALS AND METHODS 9
Ⅱ-1. Cell culture 9
Ⅱ-2. Generation of plasmid vectors and infection of cells 9
Ⅱ-3. RNA isolation and PCR 10
Ⅱ-4. Quantitative real time reverse transcription polymerase chain reaction (qRT-PCR) 10
Ⅱ-5. Immunoblotting 11
Ⅱ-6. Cell proliferation assay 12
Ⅱ-7. Sphere formation assay 12
Ⅱ-8. Wound healing assay 13
Ⅱ-9. Spreading assay & Immunofluorescence 13
Ⅱ-10. Treatment of DNA damage agents 14
Ⅱ-11. Statistical analysis 14
Ⅲ. RESULTS 17
III-1. Profilin-1 regulates actin cytoskeleton organization in human keratinocyte 17
III-2. PFN1 plays an important role in cell adhesion in human keratinocytes 21
III-3. PFN1 participates in cell proliferation and spheroid formation ability in human keratinocyte. 26
III-4. Depletion of PFN1 accelerates apoptosis induced by DNA damages 29
III-5. Alteration of subcellular localization of PFN1 upon DNA damage and repair 31
III-6. Regulation of PFN1 in DNA damage response and repair machinery in doxorubicin-induced DNA double-stranded breaks 33
III-7. PFN1 regulation of DNA damage response and repair machinery in response to Ultraviolet radiation B-mediated DNA damage 38
Ⅳ. DISCUSSION 41
Ⅴ. CONCLUSION 47
Ⅵ. REFERENCES 49
ABSTRACT IN KOREAN 62

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