염증은 감염 등의 외부 자극이나 조직 손상에 의한 면역반응이다. 대식세포와 같은 면역세포가 외부 물질로부터 자극을 받게 되면 세포 내에서 여러 가지 신호전달이 활성화되고, 염증매개물질들을 분비하여 염증 반응을 일으킨다. 과도한 염증반응은 세포사멸, DNA 손상을 초래하여 만성염증질환 등의 질병을 일으킬 수 있으므로 적절한 수준의 염증 반응은 중요하다. 현대사회에서는 다양한 합성 항염증제가 이용되고 있지만 안전성에 관한 문제 때문에 최근에는 다양한 기능성 성분을 함유하고 있는 천연 항염증 소재에 대한 관심이 증가하고, 보다 높은 기능성과 안전성이 요구되는 천연 소재 개발에 대한 연구가 이루어지고 있다.
구기자나무에 대한 선행연구에 의하면 구기자와 뿌리 껍질에는 항산화와 항염 효과가 있으며 구기엽에도 항산화 및 항균 활성이 있다. 본 연구에서는 천연 소재로써 항염 활성을 갖는 구기엽의 활용 가능성을 탐색하고 구기자와 비교, 검토하고자 하였다. 아울러 구기엽에 있는 클로로필 색소는 식품이나 화장품 소재로 사용할 때 불안정하고 제품의 색상을 어둡게 하는 문제가 있어 산업계에서는 제거하는 기술을 필요로 하고 있다. 그러나 클로로필은 인체에서 근육 색소로 전환 되어 항염, 혈행 개선 작용을 보이므로 유용한 측면이 있어 색소 제거 후 생리 활성에 대한 검토가 필요하였다(50).

1. 구기자 및 구기엽, 클로로필을 제거한 구기엽 추출물들의 항산화 효능을 검증하기 위해 총 폴리페놀 및 플라보노이드 함량을 측정한 결과, LLCh- > LL > LF 추출물 순으로 나타났다. 또한 DPPH, ABTS 라디컬 소거능과 FRAP value를 측정하여 항산화 활성을 측정한 결과에서도 LLCh- 추출물이 항산화 활성이 가장 높은 것으로 확인하였다.

2. 구기자 및 구기엽 추출물을 31.25~1,000 μg/mL의 농도로 24시간 동안 RAW264.7 대식세포에 처리했을 때 1000 μg/mL까지 세포 독성이 없는 것을 확인하였으며, 클로로포름을 이용하여 클로로필을 제거한 구기엽도 같은 농도까지 세포 증식률에 영향이 없는 것을 확인하였다.

3. 대식세포는 LPS 자극에 의해 활성화 되어 NO 및 염증성 사이토카인 등을 생성하면서 염증반응에 관여한다. 따라서 RAW264.7 세포에 LPS와 구기자 및 구기엽 추출물을 동시에 처리한 후, 주요 염증매개물질인 NO, TNF-α, IL-6, IL-1β 생성량을 측정한 결과, 모든 추출물이 NO, TNF-α, IL-6, IL-1β의 생성을 효과적으로 저해함을 확인하였다. 또한 NO 및 염증성 사이토카인의 생성 억제가 iNOS, COX-2의 단백질 발현과 관련이 있는지 확인해보기 위해 western blot을 실시한 결과, 구기자 및 구기엽 추출물이 iNOS와 COX-2의 발현에 뚜렷한 억제 효과를 보였다.

4. RAW264.7 세포에서 LF 및 LL, LLCh- 추출물들의 실험결과를 바탕으로 구기자 추출물보다 구기엽 추출물의 항염증 효과가 우수하였고, 본 연구에서는 구기엽의 활용이 주요 목적이었으므로 구기엽 추출물의 항염 효능을 동물모델에서 확인하였다. 그 결과, 염증 지표로서 혈청 TNF-α, IL-6, IL-1β의 생성량을 측정한 결과, LPS 투여 후 TNF-α의 생성량은 LPS 단독 투여군 대비 구기엽 추출물 투여군에서 모두 유의하게 낮은 수준을 보였고, IL-6 생성량은 LPS 단독 투여군 대비 클로로필을 제거한 구기엽 추출물에서는 유의하게 낮은 수준을 보였으나, 구기엽 추출물에서는 낮아지는 경향만 확인하였다(p<0.05). 혈청 IL-1β 농도를 측정한 결과, LPS 단독 투여군 대비 구기엽 추출물에서 낮아지는 경향을 보였으나 유의한 차이는 없었다. 또한 림프구 DNA 손상을 억제시킬 수 있는지 확인하기 위해 comet assay를 실시한 결과, Tail DNA, tail length, tail moment의 모든 지표에서 LPS 단독 투여군에 비해 구기엽 추출물 투여군의 값이 유의하게 감소하였다(p<0.05). 따라서 구기엽 추출물을 7일간 투여한 군들에서 혈청 염증성 사이토카인 수준이 감소하여, 구기엽 추출물들의 항염 효능 및 세포 보호 효과를 보여주었다.

결론적으로 구기엽 추출물은 LPS로 처리한 RAW264.7 세포에서 NO와 TNF-α, IL-6, IL-1β 생성을 억제하고 iNOS 및 COX-2의 발현을 저해시켰으며 구기자에 비해서도 그 효과는 낮지 않았다. 또한 구기엽 추출물들 모두 LPS로 염증반응을 유도한 BALB/c 동물모델에서 뛰어난 항염증 및 세포 보호 효과를 나타내었다. 따라서 구기엽 추출물과 클로로필 제거 구기엽 추출물들은 항염 활성을 보이는 천연소재로서 활용 가능하며 원료 표준화에 대한 연구를 수행한다면 구기자 나무의 부가가치를 높일 수 있는 수단이 될 수 있을 것이다.

Medicinal herbs have recently become attractive as health beneficial foods and as source materials for drug development. Recent studies have demonstrated that extracts of Lycium’s fruits and roots have various physiologically active substances. The extract of Lycium’s leaves has also been reported to have excellent anti-oxidant and anti-microbial activity. However it’s anti-inflammatory efficacy is not yet known. The chlorophyll present in leaves can act as an anti-oxidant or an pro-oxidant depending on the presence of light. Therefore, we analyzed the anti-inflammatory effect of Lycium’s fruit extract(LF), leaf extract(LL) and chlorophyll removal leaf extract(LLCh-). In this study, we investigated the inhibitory effects of LF, LL, LLCh- on pro-inflammatory mediator production as well as on the expression of iNOS and COX-2 in lipopolysaccharide (LPS)-stimulated RAW264.7 cells and BALB/c mice. LF, LL and LLCh- inhibited the production of pro-inflammatory mediators (NO, TNF-α, IL-6 and IL-1β) and the expression of iNOS and COX-2 in LPS-stimulated RAW 264.7 cells in a dose-dependent manner. Furthermore, the administration of LL and LLCh- inhibited serum pro-inflammatory cytokine levels and suppressed DNA damage in BALB/c mice. In particular, LLCh- showed the highest anti-inflammatory activity. These results suggested that not only Lycium’s fruit and but also leaf have a potential as a therapeutic agent against inflammation.