Fine Mapping and Identification of Candidate Genes of the Root-Knot Nematode (Meloidogyne incognita) Resistance Locus Me7 in Pepper (Capsicum annuum) :고추(Capsicum annuum)의 뿌리혹 선충 (Meloidogyne incognita) 저항성유전자 Me7의 정밀지도 작성 및 후보유전자 동정

Amornrat Changkwian

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자료유형: 학위논문

저자정보: Amornrat Changkwian (서울대학교, 서울대학교 대학원)

지도교수: 강병철

발행연도: 2019

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이 논문의 연구 히스토리 (3)

2019

Fine Mapping and Identification of Candidate Genes of the Root-Knot Nematode (Meloidogyne incognita) Resistance Locus Me7 in Pepper (Capsicum annuum)

Amo , n , at Changkwian 식물생산과학부 2019.01 학위논문

2018

Fine Mapping of the Root-Knot Nematode (Meloidogyne incognita) Resistance Locus Me7 in Pepper (Capsicum annuum)

Amo , n , at Changkwian 외 7명 한국원예학회 학술발표요지 2018.05 학술대회자료

2016

Molecular Mapping of the Root-Knot Nematode (Meloidogyne incognita) Resistance Gene Me7 in Pepper and Histological Characterization of the Parental Lines

Amo , n , at Changkwian 외 7명 한국원예학회 학술발표요지 2016.05 학술대회자료

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뿌리혹선충(Meloidogyne incognita)은 전세계적으로 고추(Capsicum annuum) 생산에 심각한 피해를 끼치는 병원균이다. 기존 연구에 의하면, 단일우성 뿌리혹선충 저항성 유전자 Me7은 염색체 9번의 장완 부분에서 존재하는 것으로 보고되었다. 본 연구에서는 뿌리혹선충 저항성인 C. annuum CM334와 이병성인 C. annuum ECW30R을 교배하여 얻은 714개의 F2 집단을 이용하여 Me7 유전자의 정밀 유전자 지도를 작성하였다. 뿌리혹선충은 CM334에서 뿌리혹선충의 유충기가 억제되고 먹이 공급 부분의 비대화가 억제되며, 뿌리혹의 형성이 현격히 줄어드는 것으로 보인다. F2 집단에서의 뿌리혹선충의 병리검정을 통해 558개의 저항성 개체와 156개의 이병성 개체를 확인하였으며, 이는 선충저항성 유전자가 단일우성일 때 관찰되는 저항성 개체:이병성 개체 (3:1) 의 비율과 통계적으로 유의미하게 일치하였다. C. annuum CM334 표준유전체 서열과 BAC 라이브러리 검정을 통해 Me7의 정밀 지도 작성을 수행하였고, Me7 유전자좌를 두 개의 분자표지 (G21U3, G43U3) 범위로 줄였다. 이 구간은 물리적 거리로 환산하였을 때, CM334 염색체 9번의 약 394.7 kb이며, Dempsey scaffold 10번의 약 198 kb 구간으로 확인되었다. 총 9개의 마커가 이 Me7 후보 지역과 공분리되었다. RenSeq 방법을 이용한 분리형별 혼합분석을 수행하여 Me7 유전자좌와 동일한 대립유전자를 가지는 값인 -0.3보다 작은 유의미한 ?(SNP-index) 값을 관찰할 수 있었다. 염색체 9번 (224.92 ~ 270.94 Mb) 에서 99%의 신뢰도를 가지는 SNP/InDel은 총 492개가 확인되었다. 그 중 104개의 SNPs/InDels이 16개의 후보유전자에 분포하였으며, 후보유전자의 길이는 0.192 kb에서 2.835 kb까지 다양하게 확인되었다. 16개의 후보유전자 중에서 두 개의 CNL type의 유전자(1640.1, 1640.7) 에서는 missense, nonsense, InDel로 인한 염기서열 변이가 확인되었다. 다른 세 개의 non-CNL type의 유전자 (1640.6, 1640.15, 1640.21) 에서는 오로지 missense 변이만이 확인되었다. 또한 오직 1640.6 유전자에서만 RT-PCR 분석을 통해서 저항성과 이병성 개체 간 발현량 차이를 확인할 수 있었다. 추가 염기서열분석을 통해 1640.7에 존재하는 SNP만이 감수성 식물체에서 종결코돈을 형성하는 것을 확인할 수 있었다. 유전자 1640.7는 CNL type의 RX-CC-NBS-LRR-like 단백질을 암호화하며, 그 아미노산의 길이는 nonsense 변이로 인하여 CM334에서는 899 aa, ECW30R에서는 502 aa으로 확인되었다. 두 개의 후보 유전자 1640.6과 1640.7은 HR반응을 통한 저항성 반응에 관여하며 먹이 공급 부분의 비대화를 억제할 것이라 예측된다.

The root-knot nematode (RKN) Meloidogyne incognita severely reduces yields of pepper (Capsicum annuum) worldwide. A single dominant locus, Me7 conferring RKN resistance was previously mapped on the long arm of pepper chromosome P9. In the present study, the Me7 locus was fine mapped using an F2 population of 714 plants derived from a cross between the RKN-susceptible parent C. annuum ECW30R and the RKN-resistant parent C. annuum CM334. CM334 exhibits suppressed RKN juvenile movement, suppressed feeding site enlargement and significant reduction in gall formation compared with ECW30R. RKN resistance screening in the F2 population identified 558 resistant and 156 susceptible plants, which fit a 3:1 ratio confirming that RKN resistance is controlled by a single dominant gene. Using the C. annuum CM334 reference genome and BAC library sequencing, fine mapping of Me7 markers was performed. The Me7 locus was delimited between two markers G21U3 and G43U3 covering a physical interval of approximately 394.7 kb on the CM334 chromosome P9 corresponding to the ~198 kb region on Dempsey scaffold 10. Nine markers co-segregated with the Me7 gene. A total of 42 genes were predicted in the ~394.7 kb CM334 Me7 region, while in the corresponding Dempsey region of ~198 kb detected only 30 genes. Bulked segregant analysis (BSA) using Resistance gene enrichment Sequencing (RenSeq) sequence data enabled detection of SNPs with significant ?(SNP-index) value <-0.3 linked to the Me7 locus. A total of 492 SNPs/InDels were detected in 224.92 ? 270.94 Mb on P9 at the significance level of 99%. Among the variants, 104 SNPs/InDels were located within the 16 candidate genes. The sizes of candidate genes ranged 0.192 kb to 2.835 kb. Among the 16 candidate genes, two Coiled coil-Nucleotide binding site-Leucine rich region (CNL) gene types (1640.1 and 1640.7) showed presence of missense, nonsense and InDels mutations, whereas three non-CNL genes (1640.6, 1640.15 and 1640.21) had only missense mutation. RT-PCR analysis showed expression difference between resistant and susceptible parents only in 1640.6. The sequence analysis showed that a SNP in 1640.7 gene causes a stop codon in the 1640.7 allele of susceptible parent. The 1640.7 allele of CM334 encodes a CNL type RX-CC-NBS-LRR like protein with a size of 899 aa, whereas the susceptible allele of ECW30R encodes 502 aa due to the nonsense mutation in the first exon. Two candidate genes 1640.6 and 1640.7 are proposed to be involved in resistance response for hypersensitive response (HR) and suppression of feeding site enlargement.

#Co-segregating markers #dominant locus #fine mapping #Me7 #NBS-LRR #RenSeq #resistance gene

ABSTRACT i
LIST OF TABLES vi
LIST OF FIGURES vii
LIST OF ABBREVIATIONS ix
GENERAL INTRODUCTION 1
CHAPTER I. Fine Mapping of the Root-Knot Nematode (Meloidogyne incognita) Resistance Locus Me7 in Pepper (Capsicum annuum)
ABSTRACT 12
INTRODUCTION 13
MATERIALS AND METHODS 16
Plant materials 16
Nematode inoculation 16
Nematode resistance screening 17
Analysis of histological responses 17
Genomic DNA extraction 18
Analysis of previously reported Me linked markers 18
Marker development 20
Genotype analysis 23
BAC library screening 26
Comparative analysis of the Me7 linked markers and physical maps 26
Fine mapping and gene prediction 26
RESULTS 28
Analysis of compatible and incompatible responses to RKN 28
Phenotyping and inheritance assay 32
Development of markers closely linked to the Me7 locus 34
BAC library screening, sequence analysis and marker development 36
Fine mapping of the Me7 locus 38
Prediction of the Me7 gene candidates and coding sequence (CDS) analysis 41
DISCUSSION 45
REFERENCES 50
CHAPTER II. Bulked Segregant RenSeq Analysis Pinpoints Candidate Genes for the Root-Knot Nematode (Meloidogyne incognita) Resistance Gene Me7 in Pepper (Capsicum annuum)
ABSTRACT 61
INTRODUCTION 62
MATERIALS AND METHODS 64
Comparative analysis of the Me7 locus 64
RenSeq library construction 64
Reference-based SNPs/InDels calling and candidate genes selection 65
Gene structure prediction 65
RNA extraction and complementary DNA (cDNA) synthesis 66
Semi-quantitative RT-PCR analysis 66
Sequence validation and full-length gene sequencing 68
Identification of suitable susceptible host for heterologous expression of the Me7 candidate genes 71
RESULTS 72
Comparative analysis of the Me7 locus 72
Bulked segregant analysis using RenSeq 77
Identification and analysis of SNPs and InDels using RenSeq 80
Validation of sequence variations in candidate genes 84
Reannotation of the candidate gene and full-length investigation 86
Hosts for heterologous expression of Me7 candidate genes for functional studies 90
DISCUSSION 92
REFERENCES 95
ABSTRACT IN KOREAN 103

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