Kordia jejudonensis의 방어시스템에서 Argonaute과 그 연관 단백질의 Nuclease 활성 분석 :Characterization of Nuclease activity of Argonaute and its associated protein from the defense system of Kordia jejudonensis

김승윤

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자료유형: 학위논문

저자정보: 김승윤 (숭실대학교, 숭실대학교 대학원)

지도교수: 임동빈

발행연도: 2020

저작권: 숭실대학교 논문은 저작권에 의해 보호받습니다.

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Argonaute은 생명의 모든 영역에 걸쳐 보존된다. 이 argonaute protein은 eukaryote에서 처음 발견되었으며, 이후에 많은 종의 bacteria와 archaea에서도 eukaryotic argonaute과 homologus한 prokaryotic argonaute(pAgo)이 발견되었고, 최근에는 pAgo가 nucleic acid-guided host defence system을 매개한다는 것을 확인하였다. pAgo는 크게 long pAgo, short pAgo, PIWI-RE protein의 세 종류로 나눌 수 있다. 우리는 이 중 short pAgo를 연구하기 위해 in silico 상에서 short pAgo를 갖고 있다고 밝혀진 Kordia jejudonensis 균주를 이용하였다. 지금까지 실험적으로 연구된 적 없는 short pAgo와 그 연관 단백질을 정제한 후, 세포 내에서 두 단백질의 역할을 알아보기 위하여 실험을 진행하였다. 본 연구에서는 K.jejudonensis의 ago와 그 연관 단백질이 complex로 발현되게 cloning하여 수용성으로 발현시킨 뒤, Ni-NTA법으로 1차 정제를, FPLC를 이용한 size exclusion을 통하여 2차 정제를 실시하였다. 그 후 정제한 complex protein을 가지고 nuclease activity test를 진행하여 이 complex protein이 어떤 nucleic acid를 target과 guide로 삼는지 확인하였다. 그 결과 이 complex protein은 RNA-guided ssDNA nuclease라고 여겨지며, 이 기능을 통해 세포 내에서 bacterial defense system으로 사용될 수 있다는 가능성을 추정해보았다. 본 논문에서는 앞서 말한 실험 과정과 그 결과에 대해 소개하고, 이후의 개선방향과 추가적인 연구의 방향을 제시할 것이다.

#prokaryotic argonaute

제 1 장 Introduction 1
1.1 Argonaute 1
1.1.1 Eukaryotic Argonaute 1
1.1.2 Prokaryotic Argonaute 2
1.2 Short pAgo 6
1.3 Kordia jejudonensis 7
1.4 연구 목적 8
제 2 장 Materials and Methods 10
2.1 Materials 10
2.1.1 DNA cloning 10
2.1.2 Protein expression 13
2.1.3 Protein purification 13
2.1.4 FPLC 13
2.1.5 Activity test 13
2.2 Methods 13
2.2.1 DNA cloning 13
2.2.2 Protein expression 15
2.2.3 Cell lysis 15
2.2.4 Protein purification 15
2.2.5 Complex DNA cloning 16
2.2.6 Complex protein expression 17
2.2.7 Complex cell lysis 17
2.2.8 Complex protein purification 17
2.2.8.1 Nickel affinity chromatography 17
2.2.8.2 Size exclusion 18
2.2.9 Activity test 18
2.2.9.1 dsDNA nuclease activity test 18
2.2.9.2 ssDNA nuclease activity test 18
2.2.9.3 Guided nuclease activity test 19
제 3 장 Result 20
3.1 Protein purification 20
3.1.1 Protein expression 20
3.1.2 Ni-NTA purification 22
3.2 Complex protein purification 23
3.2.1 Complex protein expression 23
3.2.2 Ni-NTA purification 24
3.2.3 Size exclusion purification 25
3.3 Activity test 27
3.3.1 dsDNA nuclease activity test 27
3.3.2 ssDNA nuclease activity test 28
3.3.3 Guided nuclease activity test 29
제 4 장 Discussion 30
참고문헌 32

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