DNCB로 유도된 마우스의 아토피 피부염에 대한 연교의 효능연구 :

목정일

학위논문

저자정보: 목정일 (대구한의대학교, 대구한의대학교 대학원)

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아토피 피부염은 건조, 가려움증, 염증, 수면 장애 및 심한 가려움증을 특징으로 하는 만성 및 재발성 피부질환이다. 최근 한국의 산업 도시 지역에 사는 어린이들에서 아토피 피부염의 발생률이 점차 증가하고 있다. 아토피 피부염에 대한 현재의 국소 및 전신 치료는 합리적이며 효과적이지만 심각한 부작용과 밀접한 관련이 있다. 따라서 효과적이고 안전한 아토피 치료법의 개발이 시급하다.
連翹는 오랫동안 한의학에서 염증성 질환을 치료하는 데 사용되어 왔다. 그러나 아토피 피부염에 대한 連翹의 약리학적 영향은 아직까지 불분명하다. 連翹의 항산화 활성은 시험관 내 DPPH 및 ABTS 라디칼 소거 활성을 통해 평가하였다. Balb/c 마우스 (수컷, 20-25 g)를 사용하여 2, 4?dinitrobenzene (DNCB)로 아토피 피부염 동물모델을 제작하였다. DNCB를 아세톤/올리브 오일 (3/1, v/v)에 녹이고 마우스를 200 μL의 3 % (w/v) DNCB에 노출시켜 유발시키고, 그 후 추가적으로 0.4 % (w / v) DNCB 150 μL를 사용하여 3 일에 1번씩 감작시켰다. 다음과 같이 4 개의 그룹 (그룹당 8 마리)으로 무작위로 나누었다 : 1) 정상군 : 건강한 마우스 2) 대조군 : 아토피 피부염이 유도된 마우스에 증류수를 경구 투여한 군; 3) FL : 아토피 피부염이 유도된 마우스에 連翹 100 mg/kg를 경구 투여한 군; 4) FH 아토피 피부염이 유도된 마우스에 連翹 200 mg/kg를 경구 투여한 군이다. 부검 때 등 피부조직은 적출 하여 조직병리학적 분석을 하였다. 비장 및 림프절 무게를 재고 ELISA로 혈청 면역글로불린 (Ig)E, Eotaxin 및 IL-6을 측정하였다. Western blotting을 사용하여 항산화 단백질, 염증성 및 항염증성 단백질을 분석하였다.
종합적으로 連翹는 등 피부병변을 유의하게 개선시키고 DNCB에 의해 증가 된 IgE, Eotaxin 및 IL-6의 혈청 수준을 억제함을 보여주었다. 連翹 투여는 nuclear factor-kappa B (NF-κB)의 활성을 억제함으로써 염증성 사이토카인의 생성을 억제하였다. 반면에 連翹 200 mg/kg 투여는 항염증성 사이토카인인 IL-10을 유의하게 증가시켰다. 또한, 連翹 투여는 SOD 및 GPx-1/2와 같은 항산화 효소의 단백질 발현을 유의하게 증가시켰다.
이러한 결과는 連翹가 아토피 피부염 유사 염증성 피부질환의 치료에 유용하고 치료에 적용이 가능한 후보물질일 수 있음을 입증한다.

Atopic dermatitis (AD) is a chronic and relapsing disease characterized by dryness, pruritus, inflammation, sleep disturbance, and intense itching. In recent years, the incidence of AD in children living in an industrial urban area of Korea has gradually increased. Current topical and systemic treatments for AD are reasonably effective but are associated with inconvenient adverse effects. Therefore, there is an urgent need for the development of effective and safer therapy of AD.
Forsythia Fructus (FF) have long been used in Korean medicine to treat inflammatory disorders. However, the pharmacological effects of FF on AD remain unclear. The anti-oxidant activity of FF was determined through DPPH and ABTS radical scavenging activity in vitro. Balb/c mice (male, 20?25 g) were used to construct AD model with 2, 4?dinitrobenzene (DNCB). DNCB was solubilized in acetone/olive oil (3/1, v/v) and the mouse was sensitized by 200 μL of 3% (w/v) DNCB and then the added sensitization was performed daily for three consecutive days using 150 μL of 0.4% (w/v) DNCB. The animals were randomly divided into 4 groups (8 mice per group) as follows: 1) Normal: healthy mice 2) Control: AD-induced mice treated with DW; 3) FL: AD-induced mice treated with FF 100 mg/kg/day; 4) FH: AD-induced mice treated with FF 200 mg/kg/day. At the end of the experiments, the treated dorsal skin underwent histopathological analysis. Spleen and lymph node were weighted and serum immunoglobulin (Ig)E, Eotaxin, and IL-6 measured by ELISA. Western blotting were used to analyze anti-oxidant proteins, inflammatory proteins, and anti-inflammatory cytokine. Results showed that FF significantly improved dorsal skin lesions and suppressed the serum levels of IgE, Eotaxin, and IL-6 increased by DNCB. Furthermore, treatment with FF promoted anti-inflammatory cytokine such as IL-10. In addition, FF inhibited inflammatory cytokines by the suppression of nuclear factor-kappa B (NF-κB) activation. Meanwhile, FF elevated the protein expressions of anti-oxidant enzymes such as SOD and GPx-1/2. These results demonstrate that FF may be a useful and feasible tool for the therapy of AD-like inflammatory skin diseases.

Ⅰ. 서 론……………………………………………………………………………1
Ⅱ. 재료 및 방법…………………………………………………………………3
1. 재료……………………………………………………………………………3
1) 시약………………………………………………………………………3
2) 동물………………………………………………………………………4
3) 약재………………………………………………………………………4
4) 실험기기…………………………………………………………………6
2. 방법……………………………………………………………………………6
1) 약물투여와 군 분리……………………………………………6
2) 아토피 피부염 유도……………………………………………7
3) 혈청 IgE 측정……………………………………………………8
4) 혈청 Eotaxin 측정………………………………………………8
5) 혈청 Interleukin 6 측정………………………………………………9
6) DPPH 라디칼 소거능 측정…………………………………………10
7) ABTS 라디칼 소거능 측정…………………………………………11
8) 단백질 발현량 분석……………………………………………………12
9) 병리조직 분석…………………………………………………………13
10) 통계처리………………………………………………………………14
Ⅲ. 결 과…………………………………………………………………………15
1. 등 피부의 육안적 관찰소견…………………………………………15
2. 비장 및 림프절 무게 …………………………………………………17
3. 혈청 IgE 분석 …………………………………………………………19
4. 혈청 Eotaxin 분석 ………………………………………………21
5. 혈청 Interleukin 6 분석 ………………………………………………23
6. DPPH 라디칼 소거 활성 효과…………………………………………25
7. ABTS 라디칼 소거 활성 효과………………………………………26
8. 단백질 발현량 분석…………………………………………………28
1) p-IκBα 분석…………………………………………………………28
2) NF-κBp65 분석……………………………………………………30
3) COX2 분석………………………………………………………………32
4) iNOS 분석………………………………………………………………34
5) TNF-α 분석…………………………………………………………36
6) IL-6 분석………………………………………………………………38
7) IL-1β 분석……………………………………………………………40
8) IL-10 분석……………………………………………………………42
9) HO-1 분석……………………………………………………………44
10) SOD 분석……………………………………………………………46
11) Catalase 분석…………………………………………………………48
12) GPx-1/2 분석……………………………………………………50
9. 조직병리학적 변화에 미치는 영향……………………………………52
Ⅳ. 고 찰…………………………………………………………………………54
Ⅴ. 결 론…………………………………………………………………………61
참고문헌…………………………………………………………………………63
국문초록…………………………………………………………………………73
Abstract…………………………………………………………………………75

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