Comparison and Evaluation of Bone Formation and Growth Factor carrying Ability of Novel Bone Graft(β -TCP collagen) :새로운 합성골(β -TCP collagen) 이식재의 골 형성 및 성장인자 담지 능력의 비교 및 평가

이동건

학위논문

저자정보: 이동건 (고려대학교, 고려대학교 임상치의학대학원)

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서론: 구강악안면영역에서의 골 결손은 여러 가지 원인으로 인해 나타날 수 있으며, 적절한 기능 및 회복을 위해 골이식이 필요할 수 있다. 현재는 자가골이 gold standard로 여겨지고 있으나, 추가 수술 및 제한적인 채취량 등의 한계로 이종골 및 합성골이 개발되어 널리 사용되고 있다. 하지만 이종골 및 합성골은 골전도 (osteoconduction)만을 가지며, 면역반응 등의 한계 때문에 이를 극복하기 위한 많은 연구가 진행되고 있다. 한편, 골 형성 및 재생에 효과적인 합성골 이식재를 개발하고 개발된 합성골 이식재의 골 재생능력을 평가하여 소재의 우수성을 확인하고 실용화 가능성을 평가하기 위하여 손상 뼈 동물 모델을 이용한 in vivo 실험이 필수적이라 할 수 있다. 이에 본 연구에서는백서 (rat) 두개골의 골 결손 부위에 골형성을 위한 합성골 이식재를 이식 처리하여, 골 형성 능력의 향상정도를 평가하고자 하였다.
재료 및 방법: 본 연구의 In vitro test에서는 이식재에 따라 골 발현 지표를 이용해 골 형성 능력을 평가하였으며, in vivo test를 위해 16마리의 체중 250-300g, 생후 9주차의 수컷 백서(Sprague-Dawley rats, 오리엔트 바이오, 경기도, 대한민국)를 사용하였다. 수술은 전신마취 하에 시행하였으며, 두개부를 절개 후 판막을 거상하여 두개골의 상면을 노출시켰다. 노출된 두개골 상면에 골결손부를 형성하여. 이식재를 삽입하고 흡수성 봉합사(4-0 Vicrylⓡ, Ethicon Inc., USA)로 층간 봉합하였다. 수술 부위에 아무 처치도 하지 않은 collagen을 이식한 그룹을 대조군, β-TCP collagen 단독 및 BMP-2와 biosilica, collagen coating 처리한 그룹을 실험군으로 구분하였다.
수술 후 1, 2, 4, 6, 8주에 전신마취 하에 X-ray microtomography (micro-CT) (Skyscan 1172, bruker-microCT, Kontich, Belgium)을 이용하여 수술부위를 촬영하였다. 분석에는 CT-AN 프로그램을 이용하여 ROI를 지정하고 bone volume을 분석하였다. 모든 값은 평균 ± 표준편차 로 표시되었다. 통계 분석은 두 그룹의 비교에는 Student’s t-test와 다 그룹 비교에는 일원 분석(ANOVA)를 사용하여 측정되었으며, 다중 분산 비교를 위해 Tukey HSD post hoc test를 수행하여 다양한 캐리어가 매개 변수에 미치는 영향을 조사하였다. p-value < 0.05 를 통계적으로 유의한 것으로 간주하였다. 모든 통계 분석은 SPSS 24.0 software program (IBM, USA)을 사용하여 수행하였다.
결과: in vitro test 결과, BMP-2의 적용은 Osteocalcin (OCN)과 Osteopontin (OSP)의 발현과 높은 연관을 보였으며, biosilica 및 collagen coating을 한 carrier에서는 더 오랜 기간 동안 ALP 및 다른 골 분화 마커의 활성이 유지되는 것을 확인하였다. in vivo test에서는 모든 그룹에서 시간이 지날수록 주변부로부터 신생골이 형성되는 것을 확인할 수 있었다. Collagen만 이식한 그룹에서는 주변부의 미약한 골생성만 확인할 수 있었으나, b-TCP가 포함된 collagen block을 이식하였을 때 뚜렷하게 증가된 신생골 형성을 보였다. 또한, 이식재에 BMP-2를 첨가하였을 때, 초기에는 큰 차이를 보이지 않았으나, 4주 이후 BMP-2를 추가한 그룹에서 현저한 골 형성이 나타났고, biosilica, collagen coating을 추가로 시행한 경우 더욱 뚜렷한 골 형성 양상을 보였다.
결론: 실험에 사용된 β-TCP collagen은 골형성을 위한 이식재로써 안정적인 결과를 나타내었다. 기존 β-TCP와 collagen는 낮은 기계적 강도로 인해 빠른 용해도를 보여 골 재생 및 BMP-2 조기 방출 등의 scaffold로의 한계를 가지고 있었다. 이번 연구에서 biosilica, collagen coating을 통해 상대적으로 장기간 구조를 유지하면서 BMP-2를 서서히 방출하여 골 형성에 유리한 조건을 만들 수 있었다.

Introduction: Bone defects in the oral and maxillofacial region can be caused by a variety of causes, and bone grafts may be necessary for proper function and recovery. Currently, autogenous bone is considered as a gold standard, but due to limitations such as additional surgery and limited harvesting volume, heterogeneous and synthetic bones have been developed and widely used. However, heterogeneous bones and synthetic bones have only osteoinductive property, and possibility of immune response. Many studies have been conducted to overcome these limitations. In this study, we are developing a synthetic bone graft material that is effective for bone formation and bone regeneration, and in vivo using an injured bone animal model to evaluate the bone regeneration ability of the developed synthetic bone graft material to confirm the superiority of the material and to evaluate the possibility of practical use. In this study, in vitro experiments were conducted, and the effects of bone regeneration and formation were compared and evaluated by grafting synthetic bone using a calvarial model of rats for in vivo test.
Materials and methods: In vitro test, bone formation ability was evaluated using the bone expression markers according to the graft materials, and for in vivo test, male white paper (Sprague-Dawley rats, Orient Bio, Gyeonggi-do, Korea) of 16-weight 250-300 g and 9 weeks of age were used. For surgery, general anesthesia was performed by intramuscular injection by mixing xylazine (Rumpun, Bayer Korea) and ketamine (Yuhan Ketamine, Yuhan Corporation). After the incision was made, the flap was elevated to expose the upper surface of the skull. Bone defects are formed on the exposed skull. Graft materials were placed and interlayer closure with absorbent sutures (4-0 Vicryl®, Ethicon Inc., USA) was done. The group grafted with collagen with no treatment at the surgical site was divided into a control group, and a groups treated with β-TCP collagen alone and a group treated with BMP-2, biosilica, and collagen were divided into test groups.
At 1, 2, 4, 6, and 8 weeks after surgery, CT images of surgical sites were taken using X-ray microtomography (micro-CT) (Skyscan 1172, bruker-microCT, Kontich, Belgium) under general anesthesia. For analysis, CT-AN program was used to designate the ROI and analyze the bone volume. All values are expressed as mean ± standard deviation. Statistical analysis was measured using Student''s t-test for comparison of two groups and one-way analysis (ANOVA) for multi-group comparison, and the effect of various carriers on the parameters was performed by performing Tukey HSD post hoc test for multiple variance comparison. p-value <0.05 was considered statistically significant. All statistical analyzes were performed using SPSS 24.0 software program (IBM, USA).
Results: As a result of in vitro test, the application of BMP-2 showed a high association with the expression of OCN and OSP, and it was confirmed that the activity of ALP and other bone differentiation markers was maintained longer in the carrier with biosilica and collagen coating. In in vivo test, all groups were confirmed that new bone was formed from the periphery over time. In the group grafted only with collagen, little bone formation in the periphery was found, but when the collagen block containing β-TCP was transplanted, it showed a markedly increased new bone formation. In addition, when BMP-2 was added to the graft material, there was no significant difference in the initial stage, but after 4 weeks, significant bone formation was observed in the group to which BMP-2 was added, and when biosilica, collagen coating was additionally performed, more pronounced bone formation was observed.
Conclusion: β-TCP collagen used in the experiment showed stable results as a graft material for bone formation. Existing β-TCP and collagen showed rapid solubility due to low mechanical strength, and thus had limitations to scaffold such as bone regeneration and early release of BMP-2. In this study, it is thought that it was possible to create favorable conditions for bone formation by slowly releasing BMP-2 while maintaining a relatively long-term structure through biosilica, collagen coating.

#BMP #Biosilica #Bone remodeling #Bone regeneration #β-TCP

목 차
국문요약 1
I. Introduction 3
II. Materials and methods 6
1. Materials 6
2. in vitro osteogenesis 8
3. in vivo osteogenesis 12
4. Statistical Analysis 13
III. Results 14
1. Preparation and characterization of β-TCP/Col
and [Si/Col@β-TCP]/Col 14
2. Cell adhesion and proliferation on carriers 15
3. in vitro osteogenesis 17
4. in vivo osteogenesis 21
IV. Discussion 24
V. Conclusion 26
References 26
Abstract 31

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