Regenerative effects of folic acid on preterm premature rupture of membranes (PPROM) :조기양막파수 치료를 위한 엽산의 양막 재생효과 연구

이아영

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자료유형: 학위논문

저자정보: 이아영 (고려대학교, 고려대학교 대학원)

지도교수: 홍순철

발행연도: 2021

저작권: 고려대학교 논문은 저작권에 의해 보호받습니다.

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조기양막파수는 임신과 분만의 3-15.6% 비율로 합병증과 함께 발생한다. 조산의 약 30%가 조기양막파수에 의해 발생하지만 발병원인은 아직 규명되지 않았다. 조기양막파수는 태아와 양수를 감싸는 양막이 임신 37주 이전에 파열되어 발생한다. 이는 감염 및 조산 위험을 증가시킨다. Matrix metalloproteins (MMPs)는 조산의 위험 요소인 세포 외 기질 재건 및 자궁경부 숙성, 양수 및 융모막 투과성 그리고 태반 분리를 조절하는 것으로 알려져 있다. 엽산, 비타민 B12 그리고 DHA와 같은 미세 영양소에 의해 조절되는 세포 호모시스테인 수준 및 산화 스트레스로 인해 MMP 발현이 조절되는 것으로 알려져 있다. 엽산은 DNA 및 RNA 합성에 관여하는 효소 보조 인자이며, 세포 내 one-carbon cycle을 통해 유전자 메틸화를 조절한다. 산모에서 태아로의 엽산 전달은 folate receptor (FOLR) -α 및 -β (FR-α 및 FR-β), reduced folate carrier (RFC) 및 proton-coupled folate transporter (PCFT/HCP1)을 포함한 특정 수용체를 통해 발생한다. 엽산 수용체는 태반조직에서 발현되나 양막에서는 알려진 바가 거의 없다. 사람 태반 양막은 자가 회복 능력을 가지고 있고 엽산의 보충이 엽산 수용체와 대사 산물효소 발현을 조절함으로써 양막 조직의 재생을 촉진할 것이라고 가정했다. 본 연구에서는 amnion pore culture technique (APCT)을 사용하여 사람 양막을 이용해 새로운 생체외 조기양막파수 실험 모델을 개발했다. 그리고 양막에 대한 엽산 수용체 발현과 양막 상피 줄기세포 및 생체 외 조기양막파수 모델에서 엽산의 양막 재생효과에 대한 연구를 수행했다.
합병증없이 제왕절개한 정상분만 산모의 태반으로부터 양막을 무균 채취했다. 양막 조직 과 양막 상피 줄기세포는 분리 및 특성을 분석했다. 양막 조직의 자연치유력에 대한 연구를 위해 APCT 모델에서 다양한 기공크기를 가진 양막 조직을 이용했다. 세포증식, 엽산 수용체발현 및 조직재생은 양막 상피 줄기세포 와 APCT 모델에서 다른 엽산 농도에 따라 측정했다.
양막 상피 줄기세포는 상피 및 중간엽 세포특성을 가지고 다량의 줄기세포 특성을 가졌다. 이것은 양막의 자가 재생력을 포함하고 있음을 시사할 수 있다. 재생된 양막 조직의 기공부분은 다층세포로 덮였으며, TRA 1-60, SSEA-4, OCT-4와 같은 줄기세포 표지자에서 발현되었다.
양막 상피 세포증식에서 엽산 보충군과 대조군 간에 차이가 관찰되지 않았다. 양막조직 및 상피 줄기세포에서 엽산 수용체가 발현하였고, 엽산 보충군에서 24시간 후에 엽산 수용체 유전자 발현을 증가시켰다. APCT 모델에서 엽산 보충군은 14일 동안 양막 조직의 재생을 촉진하였다. 재생된 양막 조직에서 엽산 수용체, 대사산물효소 및 MMP-9 유전자 발현에서 엽산 보충군과 대조군 사이 차이는 없었다. 이러한 결과들을 통해, 양막을 이용한 APCT 모델은 양막의 자연치유를 입증하기 위한 효율적인 연구 시스템이다. 이 연구모델에서 관찰된 바와 같이, 재생된 양막의 기공에서 발현된 줄기세포가 파열된 막의 자발적인 회복에 기여할 수 있음을 시사한다. 엽산은 APCT모델에서 양막 조직 재생을 자극시킨다. 향후 엽산 대사 및 세포주기에 대한 연구가 필요하다.

Premature rupture of membranes (PROM) occurs in 3?15.6% of pregnancies and deliveries with complications. Approximately 30% of preterm births are caused by PROM, but its origin remains unknown. PROM occurs when the amniotic membrane surrounding the fetus in amniotic fluid ruptures before 37 weeks of pregnancy, increasing the risk of infection and preterm birth. Matrix metalloproteinases (MMPs) are known to control cervical ripening, amniotic and chorionic permeability, and placental separation by regulating ECM reconstruction and remodeling, which are known risk factors for premature birth. MMP expression is regulated by cellular homocysteine levels and oxidative stress, which are altered by micronutrients such as folic acid (FA), vitamin B12, and docosahexaenoic acid (DHA). FA is an enzyme co-factor involved in DNA and RNA synthesis and regulates gene methylation through an intracellular one-carbon cycle; it is essential for the remethylation of homocysteine. The delivery of FA from the mother to the fetus occurs through specific transporters, including folate receptor (FOLR)-α and -β (FR-α and FR-β), reduced folate carrier (RFC), and proton-coupled folate transporter (PCFT/HCP1). While FA receptors are expressed in placental tissue, little is known about their expression in amniotic membranes. I hypothesized that human amniotic membranes have a self-healing ability, and FA supplementation would stimulate the regeneration of amnion tissues by regulating FA receptors and metabolic enzyme expression. I designed a novel in vitro human experimental model of PROM with the human amnion using the amniotic pore culture technique. The studies were conducted for examining FA receptor expression on the amniotic membrane and regenerative effects of FA on human amniotic epithelial stem cells (hAESCs) and the PROM model using APCT.
Amniotic tissues were aseptically collected from the membranes covering the area adjacent to the placenta immediately after the cesarean section of full-term pregnancies without any complications. Fresh amniotic tissues and hAESCs were isolated and characterized. For research on the natural healing of amniotic tissues, an APCT model was established with different pore sizes. Cell proliferation, FA receptor expression, and tissue regeneration were measured according to different FA concentrations in the hAESCs and APCT models.
hAESCs have epithelial and mesenchymal characteristics, and a large number of stem cells are expressed in the amnion and hAESCs. Hence, I hypothesized that the amnion had a self-renewal ability. In the APCT model, the pore of the regenerated amniotic tissue was covered with multiple layers of cells and stem cell markers, such as TRA 1-60, SSEA-4, and OCT-4.
No differences were observed between the FA supplement and FA-deficient groups in the proliferation of hAESCs. FA receptors (FRα, RFC, and PCFT), which are known to be expressed in the placenta, were expressed in amniotic tissues and hAESCs. The gene expression of FA receptors increased at 24 h in the FA supplement groups. The gene expression of FRα was significantly increased in the 4 ng/ml and 40 ng/ml FA groups compared to the 0 ng/ml FA group. The gene expression of PCFT was significantly increased in the 40 ng/ml and 400 ng/ml FA groups. The RFC gene expression was significantly increased in the 40 ng/ml and 400 ng/ml FA groups. In the APCT model, supplementation with FA accelerated the repair of the amniotic tissues. The pore areas were reduced to 68.4% (0 ng/ml FA), 40.1% (4 ng/ml FA), 47.7% (40 ng/ml FA), and 43.8% (400 ng/ml FA) at 14 days from 100% at day 0. In the regenerated amniotic tissues, FA receptor, metabolic enzyme, and MMP-9 gene expression did not differ between the FA supplement groups.
APCT using the human amnion is an efficient in vitro system for demonstrating the healing of the amniotic membrane. This study shows the spontaneous regeneration and resealing of pores in the amnion using the PROM model with APCT. The presence of stem cells among other proliferative cells in the pores of the amnion, as observed in this model, suggests that stem cell recruitment and activation may contribute to the spontaneous healing of ruptured fetal membranes. FA could stimulate the regeneration of amniotic tissues in the APCT model. More samples and studies on FA metabolism and the cell cycle are warranted.

#preterm premature rupture of membranes (PPROM) #regenerative #human placenta derived amnion #amnion pore culture technique (APCT) model #folic acid

1장. INTRODUCTION 1
1.1 Preterm premature rupture of membranes (PPROM) 1
1.1.1 Clinical approach to PPROM 1
1.1.2 Previous research on PPROM 1
1.1.3 Regulation of the extracellular matrix (ECM) of the amniotic membrane 2
1.2 Human placenta-derived amniotic membranes 2
1.2.1 Human amniotic epithelial stem cells (hAESCs) 2
1.2.2 Amnion pore culture technique (APCT) model 3
1.3 Folic acid with pregnancy 4
1.3.1 Metabolism of folic acid 4
1.3.2. Research on folic acid receptors on placenta-derived cells 4
2장. MATERIALS AND METHODS 5
2.1 Amnion collection 5
2.2 Human amniotic epithelial stem cell (hAESC) isolation and culture treatment 5
2.3 Amnion pore culture technique (APCT) model 6
2.3.1 Observation of spontaneous healing using APCT 6
2.3.2 Regeneration of folic acid supplement using APCT 6
2.4 In Vitro treatment conditions 7
2.5 Flow cytometry 7
2.6 Proliferation assay 8
2.7 Quantitative real-time PCR (qPCR) 8
2.8 Immunofluorescence 9
2.9 Immunohistochemistry 9
2.10 Statistical analysis 10
3장. RESULTS 11
3.1 Characterization of the amniotic membranes and amniotic epithelial stem cells 11
3.2 Natural healing of amniotic membranes in the APCT model 15
3.3 Proliferation effects of folic acid 18
3.4 Folic acid receptor expression on amnion 20
3.5 mRNA expression of folic acid receptors in amniotic tissues and hAESCs 22
3.6 Regenerative effects of folic acid on the APCT model 24
3.7 Gene expression of MMP-9, folic acid receptors, and metabolite enzymes in regenerated amniotic tissues
26
4장. DISCUSSION 30
5장. CONCLUSION 34
6장. REFERENCES 35

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