Studies on the NAD(P)H-dependent redox control proteins in Deinococcus radiodurans :Deinococcus radiodurans의 NAD(P)H 의존적 산화-환원 조절단백질에 대한 연구

조뢰

자료유형: 학위논문

저자정보: 조뢰 (전남대학교, 전남대학교 대학원)

지도교수: 최종일

발행연도: 2021

저작권: 전남대학교 논문은 저작권에 의해 보호받습니다.

이용수17

초록· 키워드

데이노코쿠스 레디오두란스 (Deinococcus radiodurans)는 강한 감마선, UV, 산화제 및 건조에 대한 노출을 견딜 수 있는 그람 양성 세균이다. 극한 조건에 노출되어 살아남을 수 있는 능력은 많은 수의 게놈 복제, 고리 모양의 핵양체, 높은 망간 함량, 강한 활성산소족(ROS) 제거능 등에 기인한다.
D. radiodurans의 일부 항산화 효소 체계에 의한 극한 환경 내성 기작에 대해서는 연구되었지만 티오레독신 (thioredoxin, Trx) 시스템의 역할은 명확하게 연구되지 않았다. 많은 세균들은 독특한 티올 의존적 항산화 체계를 보유하고 있지만, D. radiodurans에는 산화 스트레스 조건에서 티오레독신 시스템에 중요한 역할을 하는 글루타치온이 존재하지 않는다. 전형적인 티오레독신 (Trx1) 단백질은 고도로 보존된 활성 부위 모티프인 WCGPC를 보유하는 저분자량 단백질 (12kDa)이다. 세균의 Trx2는 최근에 보고된 세포질 티오레독신의 상동 단백질이다. Trx1과 약 30%의 서열 동일성을 갖고 Trx1 대비 약 40개 잔기가 N-말단에 추가되어 있다. D. radiodurans trx1 및 trx2 유전자의 결실은 감마선, UV-C, 과산화수소 및 DNA 손상제 (MMC)에 대한 민감성을 증가시키기 때문에 다중 스트레스로부터 보호하는 역할을 하는 것으로 보인다. Trx1 및 Trx2 활성은 인슐린 환원능, 5,5''-dithiobis (2-nitrobenzoic acid) (DTNB) 환원능 측정을 통해 분석하였다. 또한 Trx2의 3차원 결정 구조를 1.96 A 해상도로 규명하였다. Trx2의 전체적인 구조는 Rhodobacter capsulatus Trx2와 매우 유사한 것으로 나타났다. Trx2의 C-말단 영역은 양쪽에 5개의 가닥과 4개의 측면 α-나선으로 구성된 중앙 β-시트를 포함하며 전형적인 티오레독신 접힘 형태를 나타낸다. N-말단 연장은 아연 이온에 대해 정방정계 결합 부위를 형성하는 두 개의 CXXC 모티프를 포함한다. Trx1 및 Trx2의 CXXC 모티프는 주로 Trx 활성 감소에 영향을 미친다. 또한 Trx에 의해 조절되는 약 14개의 상호 작용 단백질을 확인하였다. 확인된 상호 작용 단백질은 단백질 접힙/재접힘 (GroEL 및 DnaK), 황화물 산화 경로 (TST), 신호 전달 (sufB), DNA 결합 (DRA0282) 및 세린 프로테이즈 (DRA0283)를 포함한 중요한 세포 대사에 관여한다.
NrdH 레독신은 티오레독신과 유사한 기능을 하지만 글루타레독신과 높은 아미노산 서열 유사성을 갖는 작은 단백질이다. 본 연구에서는 4개의 nrdH (?dr2058, ?dr0057, ?dra0072, ?drb0110) 결실 돌연변이를 제작하고 감마선, UV-C 및 과산화수소 처리 후 생존율을 측정했다. 4개의 nrdH 돌연변이는 야생형 균주에 비해 감마선, UV-C 및 과산화수소에 대한 민감도가 크게 증가하였다. dr2085 및 dra0072의 전사 수준은 60mM 과산화수소 처리 시 약 110 배, 10kGy 감마선 조사 시 약 10배 증가하였다. DR2085, DRA0072 및 DRB0110은 티오레독신 환원 효소로부터 전자를 전달받아 인슐린과 5,5''-dithiobis (2-nitrobenzoic acid) (DTNB)의 이황화물을 촉매 반응으로 환원시키지만 DR0057은 인슐린 환원력이 약하다. DRA0072의 3차원 결정 구조가 1.78 A 분해능으로 규명되었다. 전체 구조는 Bacillus cereus의 티오레독신과 가장 유사하고 전형적인 티오레독신 접힘 구조를 가지고 있다. DRA0072의 CXXC 모티프에서 시스테인을 세린으로 치환한 돌연변이는 NADPH/TrxR 재생 시스템을 사용하여 인슐린 및 DTNB를 환원시키는 활성이 상실되었다.
티올 의존적 항산화 시스템 외에도 D. radiodurans는 산화 스트레스에 대응하기 위해 효과적인 항산화 시스템을 갖고 있다. D. radiodurans의 dr1765는 과산화수소 및 유기 하이드로퍼옥사이드의 환원과 관련된 알킬하이드로 퍼옥시데이즈 유사 단백질 (AhpD 계열)을 암호화 하는 것으로 알려졌다. 본 연구에서는 dr1765 돌연변이 균주 (?dr1765)를 제작하고 과산화수소 처리 후 생존율을 조사하였다. ?dr1765는 야생형 균주에 비해 과산화수소 저항성이 크게 감소하였다. DR1765의 3차원 결정 구조는 2.27A 해상도로 규명되었다. DR1765는 AhpD 유사 단백질들의 전형적인 알파 나선으로만 구성된 접힘 구조를 갖고 있다. DR1765와 구조적 상동성 비교를 통해 DR1765가 AhpD의 양성자 전달 체계에 보존되어 있는 Glu74-Cys86-Tyr88-Cys89-His93 모티프를 보유하는 것을 확인하였다. ?dr1765와 C86A 또는 C89A 돌연변이를 암호화하는 dr1765의 상보성 테스트를 통해 시스테인의 돌연변이가 야생형 수준으로 생존률을 복원하지 못하는 것을 확인하였다. 이러한 결과는 DR1765가 산화 스트레스로부터 세포를 보호하기 위해 AhpD로 기능할 수 있음을 시사한다.

Deinococcus radiodurans is a gram-positive bacterium and has a prominent resistance to extreme γ-ray, UV radiation, oxidizing agents and desiccation. Its ability to survive exposure to extreme conditions has been attributed several factors, as follows: a high number of genome copies, ring-like nucleoid organization, high manganese content, and a higher ability to scavenge reactive oxygen species (ROS).
While the contribution of some antioxidant enzymatic systems to the extremophilic nature of D. radiodurans has been studied extensively, the role of the thioredoxin (Trx) system has not been investigated. Many bacterial species possess specific thiol-dependent antioxidant systems, but the glutathione is absent in D. radiodurans which confers on the thioredoxin system an essential role for survival under oxidative stresses. The typical Trx (Trx1) proteins are low-molecular-mass proteins (12 kDa) that possess a highly conserved active site motif, WCGPC. Bacterial Trx2 is a recently described as a cytoplasmic thioredoxin homolog. It shares ~30% overall sequence identity with Trx1 and contains an N-terminal extension of about ~40 residues. D. radiodurans Trx1 and Trx2 seems to play a role in the protection against multiple stress, as the deletion of these genes results in increased sensitivity to γ-irradiation, UVC, oxidative stress (H2O2) and DNA damage agents (MMC). The Trx1 and Trx2 activities were measured using insulin reduction assay and 5,5’-dithiobis (2-nitrobenzoic acid) (DTNB) reduction assay. In addition, the crystal structure of Trx2 was determined at 1.96 A-resolution. The overall structure was similar to that of Rhodobacter capsulatus Trx2 (PDB ID: 2PPT). The C-terminal region of Trx2 forms a canonical thioredoxin fold with a central β-sheet consisting of five strands and four flanking α-helices on either side. The N-terminal extension contains two additional CXXC motifs which form a tetragonal binding site for a zinc ion. The CXXC motifs of Trx1 and Trx2 in the Trx fold mainly affect Trx reduction activity. Also, about 14 interacting partners of Trx were identified which might be regulated by Trx. The identified interaction proteins are involved in significant cellular processing including protein folding/refolding (GroEL and DnaK), sulfide oxidation pathway (TST), signal transduction (sufB), DNA-binding (DRA0282), and serine protease (DRA0283).
NrdH redoxins are small proteins that function as thioredoxin but own a high amino acid sequence similarity to glutaredoxins. In this study, four nrdH (?dr2058, ?dr0057, ?dra0072, ?drb0110) mutant strains were created and the survival rate was measured after γ-irradiation, UVC and H2O2 treatment. Four nrdH mutants displayed significantly increased sensitivity to γ-irradiation, UVC and H2O2 compared to the wild-type strain. The transcript levels of dr2085 and dra0072 increased ~110-fold at 60 mM H2O2 treatment and ~10-fold after exposure to 10 kGy γ-irradiation. DR2085, DRA0072 and DRB0110 catalytically reduce the disulfides of insulin and 5,5’-dithiobis (2-nitrobenzoic acid) (DTNB) by accepting electrons from thioredoxin reductase, but DR0057 shows low insulin reduction activity. The crystal structure of DRA0072 was determined at 1.78 A-resolution. The overall structure was well superimposed with thioredoxin from B. cereus (PDB ID: 3ZIT) and possessed a canonical thioredoxin fold. The single substitution mutant of Cys to Ser in the CXXC motif of DRA0072 lost the ability to reduce the insulin and DTNB by using NADPH/TrxR regeneration system.
Besides the thiol-dependent antioxidant systems, D. radiodurans has developed effective antioxidant systems to cope with this oxidative stress. dr1765 from D. radiodurans is predicted to encode an alkyl hydroperoxidase-like protein (AhpD), which is implicated in the reduction of hydrogen peroxide (H2O2) and organic hydroperoxides. In this study, dr1765 mutant strain (?dr1765) was constructed and the survival rate was examined after H2O2 treatment. ?dr1765 showed a significant decrease in the H2O2 resistance compared to the wild-type strain. The crystal structure of DR1765 was determined at 2.27 A resolution. DR1765 adopted an all alpha helix protein fold representative of the AhpD-like superfamily. Structural comparisons of DR1765 with its structural homologues revealed that DR1765 possesses the Glu74-Cys86-Tyr88-Cys89-His93 signature motif, which is conserved in the proton relay system of AhpD. Complementation of ?dr1765 with dr1765 encoding C86A or C89A mutation failed to restore the survival rate to wild-type level. Taken together, these results suggest that DR1765 might function as an AhpD to protect cells from oxidative stress.

#Deinococcus radiodurans #NAD(P)H #antioxidant system #thiol-dependent proteins #oxidation and reduction

Contents
Contents I
List of FiguresVI
List of Tables.IX
AbstractsX
Chapter I. Introduction
1.1 Deinococcus radiodurans 1
1.2 Antioxidative system 1
1.3 NAD(P)H dependent redox control system 6
Chapter II. Studies on the thioredoxin system related proteins in Deinococcus radiodurans R 1
2.1 Introduction. 8
2.2 Materials and Methods 10
2.2.1 Strains and culture 10
2.2.2 Construction of deletion mutants in D. radiodurans 10
2.2.3 γ-irradiation, UVC-light, hydrogen peroxide (H2O2) and Mitomycin (MMC) tolerance assay. 10
2.2.4 qRT-PCR. 11
2.2.5 Cloning, expression, and purification. 11
2.2.6 Crystallization and data collection of Trx2 12
2.2.7 Data processing, structure determination, and refinement of Trx2 12
2.2.8 Site-directed mutagenesis. 12
2.2.9 Capturing of target proteins by immobilized mutants of Trx1 and Trx2 13
2.2.10 Trx target proteins identification by LC/MS spectrometry 13
2.2.11 Cloning, expression, and purification of Trx target proteins 14
2.2.12 Far Western blotting. 14
2.2.13 Insulin reduction assay. 15
2.2.14 DNTB reduction assay 15
2.2.15 Survival studies 15
2.2.16 Growth curves and deinoxanthin production. 16
2.3 Results. 20
2.3.1 Phenotype assay of trx knock-out stain 20
2.3.2 Purification of Trx 23
2.3.3 Biochemical characterization of Trx 23
2.3.4 Crystallization of Trx2. 27
2.3.5 Data collection, processing, and refinement 27
2.3.6 Overall structure of Trx2 31
2.3.7 CXXC motifs and zinc binding of Trx2. 34
2.3.8 Structural comparison with other Trx proteins. 37
2.3.9 Identification of Trx interaction partner proteins. 37
2.3.10 Confirmation of protein-protein interaction. 41
2.3.11 Expression of Trx in E. coli 43
2.3.12 Expression of Trx in D. radiodurans. 43
2.4 Discussion. 46
Chapter III. Structural and functional analyses of NrdH-like proteins in Deinococcus radiodurans R 1
3.1 Introduction. 48
3.2 Materials and Methods 50
3.2.1 Strains and culture. 50
3.2.2 qRT-PCR. 50
3.2.3 Construction of deletion mutants in D. radiodurans 50
3.2.4 γ-irradiation, UVC-light, hydrogen peroxide (H2O2) tolerance assay 51
3.2.5 Cloning, expression, and purification. 51
3.2.6 Insulin disulfide reduction assay 52
3.2.7 DNTB reduction assay 52
3.2.8 Site-directed mutagenesis. 52
3.2.9 Crystallization and data collection. 53
3.2.10 Data processing, structure determination, and refinement. 53
3.2.11 Survival studies 53
3.2.12 Growth curves and deinoxanthin production. 54
3.3 Results. 59
3.3.1 nrdH gene expression under H2O2 and γ-irradiation 59
3.3.2 Phenotype assay of nrdH knock-out stain 59
3.3.3 Purification of NrdH. 62
3.3.4 Biochemical characterization of NrdH. 62
3.3.5 Crystallization of NrdH 68
3.3.6 Data collection, processing, and refinement 68
3.3.7 Overall structure of NrdH. 71
3.3.8 Functions of CXXC motifs. 71
3.3.9 Structural comparison. 74
3.3.10 Expression of NrdH in E. coli 79
3.3.11 Expression of NrdH in D. radiodurans 79
3.4 Discussion. 82
Chapter IV. Crystal structure of alkyl hydroperoxide reductase (AhpD)-like protein DR1765 from Deinococcus radiodurans R 1
4.1 Introduction. 84
4.2 Materials and Methods 86
4.2.1 Strains and culture. 86
4.2.2 Construction of deletion mutants in D. radiodurans 86
4.2.3 Complementation of dr1765 (WT, C86A, Y88H and C89A) 86
4.2.4 Phenotype assay of Δdr1765 mutant and complementary strains 87
4.2.5 qRT-PCR. 87
4.2.6 Cloning, expression and purification 87
4.2.7 Crystallization and data collection. 88
4.2.8 Data processing, structure determination, and refinement. 88
4.2.9 Survival studies 89
4.2.10 Growth curves and deinoxanthin production. 89
4.3 Results. 93
4.3.1 Gene expression and phenotypic characterization under H2O2 stress 93
4.3.2 Purification of DR1765 95
4.3.3 Crystallization of DR1765 95
4.3.4 Data collection, processing, and refinement 99
4.3.5 Overall structure of DR1765 101
4.3.6 Dimerization. 103
4.3.7 Structural comparison with other DR1765 proteins. 104
4.3.8 Active site. 108
4.3.9 Expression of DR1765 in E. coli 111
4.3.10 Expression of DR1765 in D. radiodurans 111
4.4 Discussion. 114
References 116
ABSTRACT in Korean. 126

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