대장균의 세포벽 분해효소의 중복성의 생리적 의미 :Physiological Significance of Redundancy of Peptidoglycan Hydrolases in Escherichia coli

박시형

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자료유형: 학위논문

저자정보: 박시형 (명지대학교, 명지대학교 대학원)

지도교수: 이창로

발행연도: 2021

저작권: 명지대학교 논문은 저작권에 의해 보호받습니다.

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초록· 키워드

Peptidoglycan (PG)은 박테리아 외골격의 필수 구성 요소이며 높은 팽압하에서 세포 모양과 세포 용해에 대한 저항성을 유지하는 데 중추적 인 역할을 합니다. PG는 N-acetylmuramic acid와 N-acetylglucosamine의 반복으로 구성된 거대한 polysaccharidic polymer로 glycan strand의 N-acetylmuramic acid의 pentapeptide와 다른 glycan 가닥의 pentapeptide가 교차 결합되어 그물을 형성합니다. 구조. PG의 합성 및 분해는 박테리아 세포 성장 및 분열 중에 엄격하게 조절되어야 합니다.
PG 가수 분해 효소는 대장균을 포함한 많은 박테리아에서 높은 중복성을 보여줍니다. PG 가수 분해 효소 중 E. coli는 cross-link 된 펩티드 사슬 내에서 절단되는 7 개의 PG endopeptidase를 가지고 있습니다. 이 연구를 통해 PG endopeptidase, MepM 및 MepS의 특정 표현형을 발견했습니다. mepM 및 mepS의 결실 돌연변이 체는 각각 염 감도 및 EDTA 감도 표현형을 가지고 있습니다. 보완 테스트에서 mepM 돌연변이 체의 표현형은 MepM에 의해서만 복원된 반면, mepS 돌연변이 체의 표현형은 MepH, PbpG 및 MepM의 과발현과 MepS의 발현에 의해 복원되었습니다. 도메인 교환 실험을 사용하여 mepM 및 mepS 돌연변이의 표현형이 특정 세포 위치 및 도메인과 관련이 있음을 발견했습니다. 마지막으로, mepM 및 mepS 돌연변이 체의 뚜렷한 표현형을 사용하여 PBP1a는 MepM 및 MepH에 의해 영향을 받을 수 있고 PBP1b는 MepM 및 MepH뿐만 아니라 MepS 및 PbpG에 의해 영향을 받을 수 있음을 발견했습니다. 특히, PBP1a 또는 PBP1b의 결실 돌연변이는 mepM 돌연변이와 같이 염 감도를 나타내어 PG 합성에서 MepM의 중요성을 시사합니다. 따라서 이 연구는 각 PG endopeptidase가 고유 한 도메인과 세포 위치에 따라 PG 합성에서 뚜렷한 역할을 한다는 것을 나타냅니다. DD-Carboxypeptidase는 N-acetylmuramic acid의 pentapeptide에서 5 번째 D-Alanine의 제거를 촉매하며 E. coli에는 7 개의 DD-carboxypeptidases가 있습니다. 또한 DD-carboxypeptidase 중복성의 생리 학적 중요성을 분석했습니다. DD-carboxypeptidase 결실 돌연변이체의 표현형 분석을 통해 dacA 돌연변이만이 반코마이신에 대해 강한 저항성을 보이며, 이는 PG의 D-alanine-D-alanine (D-Ala-D-Ala)에 결합하여 PG의 가교를 억제한다는 것을 발견했습니다. DacA는 정상적인 조건에서 주요 DD-carboxypeptidase로 알려져 있습니다. 반코마이신 내성은 DacA의 효소 활성과 관련이 있었고 다른 DD-carboxypeptidase의 추가 결실은 반코마이신 내성을 약간 증가시켰습니다. 형광 반코마이신 유사체를 사용한 실험을 통해, 추출된 PG에 결합하는 반코마이신의 양이 야생형 세포에서 추출된 것보다 dacA 돌연변이 체에서 추출된 PG에서 증가하는 것을 발견했으며, 이는 dacA 돌연변이 체의 반코마이신 내성이 PG의 오래된 가닥에 존재하는 증가된 D-Ala-D-Ala의 양으로 증가에 의해 발생할 수 있음을 시사하고, 이러한 오래된 가닥은 PG의 새로운 가닥의 합성에 필요한 페니실린 결합 단백질과 상호 작용하는 반코마이신의 양을 줄일 수 있습니다. 이러한 결과는 DacA가 주요 DD-carboxypeptidase이고 E. coli에서 vancomycin 내성에 관여함을 나타냅니다.

Peptidoglycan (PG) is an essential component of the bacterial exoskeleton and plays a pivotal role in maintaining cell shape and resistance to cell lysis under high turgor pressures. PG is a huge polysaccharidic polymer that is composed of the repetition of N-acetylmuramic acid and N-acetylglucosamine and is cross-linked between the pentapeptide of N-acetylmuramic acid of the glycan strand and the pentapeptide of the other glycan strand to form a net structure. The synthesis and degradation of PG must be tightly regulated during bacterial cell growth and division.
PG hydrolase shows high redundancy in many bacteria, including Escherichia coli. Among PG hydrolases, E. coli have seven PG endopeptidases that cleave within the cross-bridged peptide chains. In this study, I found a specific phenotype of PG endopeptidases, MepM and MepS. The deletion mutants of mepM and mepS have salt sensitivity and EDTA sensitivity phenotypes, respectively. In complementation tests, the phenotype of the mepM mutant was restored only by MepM, whereas that of the mepS mutant was restored by overexpression of MepH, PbpG, and MepM as well as the expression of MepS. Using domain-swapping experiments, I found that the phenotype of mepM and mepS mutants is associated with specific cellular localization and domains. Finally, using a distinct phenotype of mepM and mepS mutants, I found that PBP1a can be affected by MepM and MepH, and PBP1b can be affected by MepS and PbpG as well as MepM and MepH. In particular, the deletion mutation of PBP1a or PBP1b showed a salt sensitivity, like the mepM mutant, suggesting the importance of MepM in PG synthesis. Thus, this study indicate that each PG endopeptidase plays a distinct role in PG synthesis, depending on its unique domain and cellular localization. DD-Carboxypeptidase catalyze the removal of 5th D-alanine in the pentapeptide of N-acetylmuramic acid and there are seven DD-carboxypeptidases in E. coli. I also analyzed physiological significance of DD-carboxypeptidase redundancy. Through phenotypic analysis of DD-carboxypeptidase deletion mutants, I found that only the dacA mutant shows a strong resistance to vancomycin, which binds to D-alanine-D-alanine (D-Ala-D-Ala) of PG and subsequently inhibits the cross-linking of PG. DacA is known to be a major DD-carboxypeptidase in normal conditions. Vancomycin resistance was associated with the enzyme activity of DacA and additional deletion of other DD-carboxypeptidases slightly increased vancomycin resistance. Through experiments using fluorescent vancomycin analogue, I found that the amount of vancomycin binding to extracted peptidoglycan increased in peptidoglycan extracted from the dacA mutant compared to that from the wild-type cell, suggesting that vancomycin resistance of the dacA mutant might be caused by increased D-Ala-D-Ala amount that exists in old strands of PG, which can decrease the amount of vancomycin interacting with penicillin-binding proteins that are necessary for the synthesis of new strands of PG. These results indicated that DacA is the major DD-carboxypeptidase and is involved in vancomycin resistance in E. coli.

#Bacterial cell envelope #Peptidoglycan turnover #cell lysis #Peptidoglycan hydrolase #DD-Endopeptidase #DD-Carboxypeptidase #Redundancy #Penicillin binding proteins #Vancomycin resistance

Table of contents
List of figures iv
List of Tables vii
Abstract viii
Chapter I. Introduction 1
1. Bacterial cell envelope 1
1.1. Overview of bacterial cell envelope 1
1.2. Gram-negative bacterial cell envelope 1
1.3. Outer membrane 4
1.4. The cell wall 6
2. The peptidoglycan biosynthesis and turnover 6
2.1. Biosynthesis of peptidoglycan 6
2.2. Degradation of peptidoglycan 9
2.2.1. Lytic transglycosylase 12
2.2.2. Amidase 12
2.2.3. Peptidase 14
2.2.3.1. Endopeptidase 14
2.2.3.2. Carboxypeptidase 17
3. The aims of this study 19
Chapter II. Materials and methods 21
1. Strains and plasmids 21
2. Media and cell culture 29
3. Recombinant DNA techniques 29
3.1. Isolation, amplification, and purification of DNA for cloning recombinant plasmid 29
3.2. Cloning of the gene 30
3.3. Chimeric protein cloning 30
3.4. Site directed mutagenesis 40
3.5. Gene disruption 40
3.6. Gene insertion at the chromosome 48
3.7. Elimination of antimicrobial resistance gene 50
4. Spotting assay 50
5. CPRG assay 50
6. Detection of intracellular levels of peptidoglycan endopeptidases 51
7. Determine the intracellular location of MepM 51
8. Purification of MepM-His, His-MepS, and MepM(H314A)-His 51
9. Zymogram assay of MepM and MepS 52
10. RT-PCR analysis 53
11. Isolation of peptidoglycan 54
12. Determine the pentapeptide stem of peptidoglycan by vancomycin-BODIPY-FL 55
Chapter III. Result 56
1. Distinct roles of DD-endopeptidase in the PG synthesis 56
1.1. The phenotype of each endopeptidase depleted mutant 56
1.2. Endopeptidase activity of MepM and MepS required to derepress growth inhibition under conditions of high salinity and metal ion deficiency stress 59
1.3. Individuality of peptidoglycan endopeptidase 64
1.4. The importance of the exact location of MepM and MepS 64
1.5. Endopeptidase distinct roles associated with specific location and domains 72
1.6. The entire domain of MepM and MepS is responsible for their function 76
1.7. Distinct effects of four endopeptidases, MepM, MepS, MepH and PbpG on PBP1a and PBP1b 82
1.8. MepM required for salt stress adaptation 90
2. The relationship between DD-carboxypeptidase and vancomycin resistance 97
2.1. The vancomycin resistance by DD-carboxypeptidase deletion 97
2.2. Importance of DD-carboxypeptidase activity in vancomycin resistance 97
2.3. Vancomycin resistance is independent of antibiotic permeability. 106
2.4. Peptidoglycan maturation and vancomycin resistance 108
Chapter IV. Discussion 112
1. Redundancy of peptidases among the peptidoglycan hydrolases 112
2. Distinct functions of four peptidoglycan endopeptidases 113
3. The relationship between DD-carboxypeptidase and vancomycin resistance 118
Reference 121
국문초록 130

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