대장균의 주요한 세포벽 분해효소의 전사 후 조절 기작 연구 :Studies on Mechanisms of Post-transcriptional Regulation of Two Major Peptidoglycan Endopeptidases in Escherichia coli

김영재

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자료유형: 학위논문

저자정보: 김영재 (명지대학교, 명지대학교 대학원)

지도교수: 이창로

발행연도: 2021

저작권: 명지대학교 논문은 저작권에 의해 보호받습니다.

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초록· 키워드

세균은 세포 내부와 외부를 구분 짓고, 다양한 외부스트레스를 방어하기 위해 세포 외골격을 가진다. 이는 크게 세포막과 세포벽, 두 종류로 구성된다. 대장균의 경우 그람음성세균으로서 세포내막과 세포외막, 두 개의 세포막을 가진다. 대장균의 세포벽은 펩티도글리칸으로 구성되고, 이는 N-acetylglucosamine과 N-acetylmuramic acid의 β-1,4-결합으로 구성된 기본 골격이 서로 교차결합을 이룬 구조이다. 몇 개의 아미노산으로 구성된 곁가지 사이의 펩타이드 교차결합은 펩티도글리칸을 더욱 견고하게 만들어준다. 이런 펩티도글리칸의 견고함은 삼투 스트레스와 같은 다양한 외부 스트레스로부터 세포를 보호하는데 유리하지만, 세포가 성장할 때는 반드시 분해되어야 한다. 대장균은 많은 펩티도글리칸 가수분해효소 유전자를 가지고 있는데, 이는 작용기전에 따라 여러 군으로 분류할 수 있다.
다양한 펩티도글리칸 가수분해효소 중에서, 4-3 교차결합을 분해하는 효소를 DD-endopeptidase라 명명하는데, 대장균은 mepA, mepH, mepM, mepS, ampH, dacB, pbpG의 7가지 DD-endopeptidase 활성 단백질 암호화 유전자를 가지고 있다. 특히 mepM과 mepS 유전자는 특정 스트레스 상황에서 생장에 굉장히 중요하게 작용하고, ΔmepM ΔmepS 결손균주는 LB 배지에서 자라지 못한다. 이는 MepM과 MepS가 나머지 DD-endopeptidase에 비해 주요한 역할을 하고 있다는 것을 암시한다. Space maker로 알려진 MepS는 단백질 분해효소인 Prc에 의해 조절 받는다고 잘 알려져 있다. 하지만 MepM을 포함한 나머지 DD-endopeptidase의 조절기작에 대해선 뚜렷하게 연구되지 않았다. 이번 연구에서, 우리는 정교한 전사 후 조절 기작이 MepM과 MepS의 발현양을 조절하는 것을 관찰하였다. 주목할 점은, MepM 또한 MepS처럼 단백질 분해효소 Prc에 의해 분해되었다. 하지만 이는 Prc 보조단백질인 NlpI와는 독립적으로 조절되어 MepS 조절과는 다른 양상을 보였다. MepM, MepS의 발현양도 배지에 따라 분명하게 다른 양상을 띠었다. 두 단백질의 발현양은 아미노산이 부족한 포도당 최소배지에서 급격하게 감소했다. 그리고 이런 조절은 전사 후 조절기작을 통해 이루어졌다. MepS의 경우, Prc에 의해 조절되었지만 MepM은 Prc와는 독립적으로 이루어졌다. 흥미롭게도 ΔmepM ΔmepS 결손균주는 포도당 최소배지에서 야생형과 비슷한 성장 속도를 보였으며 배지에 아미노산을 추가하면 이러한 성장 회복이 반전되었다. 이는 아미노산이 풍부한 배지에서 MepM과 MepS의 필요성이 분명히 증가했음을 나타낸다.
MepM과 MepS가 다른 DD-endopeptidase보다 중요하다는 사실은 이미 이전 선행연구들을 통해 알려졌다. 하지만 이 두 단백질이 어떻게 조절되는지, 어떤 상황에서 필요도가 증가되는지는 자세히 연구되지 못했다. 이번 연구를 통해 MepM과 MepS의 단백질 발현양이 전사 후 과정에서 조절 받는다는 것을 관찰하였고, 아미노산이 풍부한 배지에서 그 발현량과 필요도가 증가한다는 것 또한 확인하였다.

Bacteria has an envelope to separate inside and outside of cell, and prevent diverse extracellular stresses. It is composed of two types of components, the cell membrane and the cell wall. In case of Escherichia coli, there are two cell membranes, inner membrane and outer membrane. The cell wall of E. coli is composed of peptidoglycan (PG), which is a cross-linked structure between the basic skeletons which are made of alternating β-1,4-linked sugars, N-acetylglucosamine and N-acetylmuramic acid. The cross-linking of peptide bonds between side branches composed of several amino acids ensures the rigidity of PG. Although the rigidity of PG have an advantage of protecting cell from various stresses, such as osmotic stress, it must be hydrolyzed when cell is growing. For this mechanism, E. coli has many kinds of PG hydrolases, which could be classified into various groups according to the mechanism of action.
Among various PG hydrolases, the enzyme which degrades 4-3 cross-link is called DD-endopeptidase, and E. coli has 7 genes encoding DD-endopeptidase activity-containing proteins, which are mepA, mepH, mepM, mepS, ampH, dacB, and pbpG. The mepM and mepS genes are particularly important for growth under certain stress conditions, and the ΔmepM ΔmepS double mutant is lethal in LB medium. These results imply that MepM and MepS play a major role. MepS, well known as a space maker, is regulated by a protease Prc. However, the regulatory mechanisms of other DD-endopeptidases including MepM have not been clearly studied. In this study, we observed that elaborate post-transcriptional regulatory mechanisms regulate the expression levels of MepM and MepS. Notably, MepM was also degraded by a protease Prc, like MepS. However, this regulation was independent on the Prc adapter protein NlpI, which is different from the case of MepS. The amount of MepM and MepS was clearly differentiated according to the medium. The levels of two proteins dramatically decreased in glucose M9 minimal medium which is deficient in amino acids. This regulation was achieved through post-transcriptional regulation. In the case of MepS, it was regulated by Prc, but MepM was independent of Prc. Intriguingly, the ΔmepM ΔmepS double mutant showed a growth rate comparable to the wild-type in glucose M9 minimal medium and the addition of amino acids in the medium reversed this growth recovery. These results indicates that the necessity of MepM and MepS was clearly increased in the amino acid-rich medium.
The fact that MepM and MepS are more important proteins than other DD-endopeptidases has already been known through previous studies. However, neither the mechanisms for regulating these two proteins, nor specific condition which increases the necessity of both proteins has been studied in detail. Through this study, we observed that the protein expression levels of MepM and MepS are regulated in the post-transcriptional process, and the expression levels of two proteins and their necessity were also increased in amino acid-rich medium.

#Escherichia coli #peptidoglycan #peptidoglycan hydrolase #DD-endopeptidase #MepM #MepS #Prc #NlpI #amino acid abundance #post-transcriptional regulation

목 차
목차 ⅰ
국문초록 ⅳ
제 1 장 서론
1. 연구 배경과 연구 목표
가. 연구 배경 1
1) DD-endopeptidase 기능 및 역할
2) Prc 단백질의 특성
나. 연구 목표 7
제 2 장 실험재료 및 실험방법
1. 실험 재료
가. 사용한 균주 및 플라스미드 목록 8
나. 사용한 효소와 시약 및 primer 목록 11
다. 사용한 배지 조성과 항생제 목록 16
1) 사용한 배지의 조성
2) 항생제 목록
라. Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE)
의 sample buffer와 acrylamide gel 조성 17
마. 사용한 Buffer 목록과 조성 17
바. Western blot 용액 18
1) Electrotransfer용액
2) PBS-T
3) Blocking용액
2. 실험 방법
가. 유전자 결손균주 제작 19
나. Flag-tag 균주 제작 20
다. 유전자 클로닝 21
라. 단백질 과발현 21
마. 단백질 순수 정제 22
바. 단백질의 상호작용 단백질 탐색 22
사. Western blot 실험 23
아. 단백질 활성 실험 23
자. qRT-PCR 24
제 3 장 결 과
1. DD-endopeptidase 암호화 유전자 결손균주 제작과 표현형 분석. 25
2. 배지 조건에 따른 mepM과 mepS의 발현 양상. 28
3. 단백질 분해효소 Prc에 조절 받는 또 다른 DD-endopeptidase. 30
4. Prc에 굉장히 의존적으로 조절 받는 MepS, 그에 비해 다소 복합적인 인자들
에 의해서 조절 받는 MepM. 40
5. mepM의 mRNA 안정성과 단백질 안정성. 42
6. 아미노산이 풍부한 조건에서 MepM과 MepS의 절대적 필요성. 45
7. 아미노산 풍부 또는 결핍이 가지는 의미. 52
제 4 장 고 찰 55
참고문헌 58
Abstract 63

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