Impairment of autophagic flux via oxidative stress and lysosomal dysfunction: Implications for NSAIDs-induced hepatotoxicity :비스테로이드성 항염증제의 간독성에서 산화적 스트레스와 라이소좀 기능이상을 통한 자가포식 억제작용의 역할

정승환

학위논문

저자정보: 정승환 (서울대학교, 서울대학교 대학원)

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비스테로이드성 항염증제(NSAID)는 가장 일반적으로 사용되는 소염?진통 약물이지만 위장관 질환, 심혈관 질환 및 간독성 등 다양한 부작용을 유발하여 일부 약물은 시장에서 철회되었다. Drug-Induced Liver Injury Network에 수집된 자료에 따르면 Diclofenac이 조사된 NSAID 중 가장 간 손상과 관련이 있는 것으로 보고되었다. Diclofenac의 간독성 기전은 사람 및 랫드의 간세포에서 미토콘드리아의 기능 손상과 활성산소 생성에 따른 산화적 스트레스에 의해 apoptosis가 유발되고 산화적 인산화 및 ATP 생합성을 억제하는 것으로 알려졌지만 정확한 독성 기전은 밝혀지지 않았다. 본 연구에서는 Diclofenac을 포함한 다수의 NSAID가 간세포에서 오토파지를 억제하였으며 대표적인 간독성 약물인 Diclofenac을 이용하여 오토파지와 간독성의 연관성에 관한 실험을 진행했다. Diclofenac은 간세포에서 활성산소를 유발하였고 이는 lysosome의 pH 증가 및 cathepsin의 활성을 저해시켰으며 lysosome과 autophagosome의 융합을 억제했다. Diclofenac에 의해 억제된 lysosome의 기능 및 오토파지를 lysosome 활성 약물인 clioquinol을 처리하거나 transcription factor EB를 과발현시켜 lysosome의 기능과 오토파지를 회복시켰으며, 항산화제 및 항산화 효소 과발현 실험을 이용해 Diclofenac에 의한 오토파지 기능 손상이 개선되었고 이를 통해 NSAID에 의한 오토파지 억제가 ROS 생성과 관련됨을 알 수 있다. 미토콘드리아를 선택적으로 분해하는 오토파지 기전인 미토파지 또한 Diclofenac에 의해 억제되었다. 억제된 미토파지는 활성산소를 소거하거나 lysosome을 재활성시켰을 때 회복되었고 미토콘드리아의 기능 또한 개선되었다. 대표적인 오토파지 활성약물인 rapamycin을 마우스에 투여했을 때 Diclofenac에 의해 유발된 간독성이 회복되었으며 LC3, p62 등의 오토파지 마커를 통해 Diclofenac에 의해 억제된 오토파지가 개선된 것을 확인했다. 결과적으로 Diclofenac은 ROS 생성을 유발하고 생성된 ROS를 매개로 한 lysosome의 기능 손상이 오토파지의 기능 억제를 유도한다. 억제된 오토파지는 미토콘드리아의 기능을 유지하지 못하게 하여 활성산소를 과도하게 생성한다. 이러한 결과들은 NSAID에 의한 간독성이 활성산소와 오토파지를 매개로 유발될 수 있음을 보여준다.

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I. Introduction 1
1.1 Adverse effects of nonsteroidal anti-inflammatory drugs (NSAIDs) 1
1.2. Hepatotoxicity of NSAIDs 2
1.3. Diclofenac-induced liver injury 3
1.4. The metabolism of diclofenac 4
1.5. Possible mechanisms of diclofenac-induced hepatotoxicity 5
1.5.1. Reactive metabolites 5
1.5.2. Oxidative stress and disruption of mitochondrial function 6
1.6. Autophagy 9
1.7. Types of autophagy 10
1.8. The molecular mechanism of autophagy 11
1.9. Role of autophagy in cell survival and cell death 12
1.10. The aim of study 14
II. Materials and Methods 15
2.1. Animal experiments 15
2.2. Serum Biochemistry 15
2.3. Histological analysis 15
2.4. Immunoblot analysis 16
2.5. Cell culture 16
2.6. Primary cell isolation 17
2.7. Cell confluence and viability measurement 17
2.8. Flow cytometry analysis 17
2.8.1. Measurement of ROS and mitochondrial membrane potential 17
2.8.2. Cell death analysis 18
2.8.3. Identification of oxidized mitochondrial proteins and lipids 18
2.9. Measurement of oxygen consumption rate 19
2.10. Measurement of ATP content 19
2.11. Confocal microscopy 19
2.11.1. Immunofluorescence analysis 19
2.11.2. Lysosomal activity or acidity 20
2.11.3. Mitophagy 20
2.11.4. Autophagic flux using tandem fluorescent-tagged LC3 (GFP-mCherry-LC3) 21
2.11.5. Mitochondrial fragmentation and mitochondria detection 21
2.12. Measurement of cathepsin B activity 21
2.13. Transient transfections 21
2.14. qRT-PCR analysis 22
2.15. Transmission electron microscopy 22
2.16. Antibodies and reagents 23
2.17. Statistical analysis 23
III. Results 24
3.1. Autophagy induction restored diclofenac-induced cytotoxicity and hepatotoxicity in vitro and in vivo. 24
3.1.1. Rapamycin decreased diclofenac-induced cytotoxicity and diclofenac-induced hepatotoxicity. 24
3.1.2. Rapamycin reduced the accumulation of autophagy marker proteins by diclofenac in vitro and in vivo. 27
3.2. Diclofenac inhibited autophagy and autophagic flux in hepatocytes. 29
3.2.1. Diclofenac induced the autophagosome accumulation in HepG2 cells and mouse primary hepatocytes (MPH). 29
3.2.2. Diclofenac did not affect the biogenesis of a preautophagosomal structure. 32
3.2.3. Diclofenac inhibits autophagic flux in hepatocytes. 34
3.3. Diclofenac induced ROS-mediated increase in lysosomal pH and lysosomal dysfunction, and blocked autophagosome-lysosome fusion in hepatocytes. 36
3.3.1. Diclofenac induced the accumulation of damaged mitochondria and mitochondrial dysfunction in human hepatoma cells. 36
3.3.2. Diclofenac produced intracellular and mitochondrial ROS and induced mitochondrial oxidative stress. 39
3.3.3. Diclofenac impaired lysosomal activity and function. 41
3.3.4. Diclofenac-mediated ROS production was responsible for the inhibition of lysosomal function and autophagy. 43
3.3.5. Diclofenac also inhibited autophagic flux by impairing the autophagosome-lysosome fusion. 46
3.3.6. Reactivation of lysosomal function restored the autophagic flux suppression by diclofenac. 48
3.3.7. Diclofenac also induced ROS production, mitochondrial dysfunction and autophagy impairment in mouse primary hepatocytes. 51
3.3.8. NSAIDs increased cellular ROS levels and inhibited autophagic flux in human hepatoma cells. 55
3.3.9. ROS from nadph oxidase 3 (NOX3) and xanthine oxidase have little effect of diclofenac on autophagy inhibition. 59
3.4. Diclofenac inhibited the colocalization of mitochondria and lysosomes and mitophagy in human hepatoma cells. 61
3.5. Diclofenac-induced cytotoxicity is closely implicated in autophagy 65
3.6. Autophagy inhibition by NSAIDs is independent of COX inhibition activity. 67
IV. Discussion 70
V. Conclusion 80
VI. References 82
국문초록 98

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