Metagenomic analyses of endophytic fungi from oak trees and biological activities of endophytic fungal isolates against oak wilt fungus (Raffaelea quercus-mongolicae) in Korea :참나무 내생균의 메타 유전학적 분석 및 내생균 균주의 참나무 시들음병균(Raffaelea quercus-mongolicae)에 대한 생물학적 활성

Nguyen Manh Ha

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자료유형: 학위논문

저자정보: Nguyen Manh Ha (강원대학교, 강원대학교 대학원)

지도교수: Jong Kyu Lee

발행연도: 2021

저작권: 강원대학교 논문은 저작권에 의해 보호받습니다.

이용수5

초록· 키워드

식물내생균류는 다양하고 풍부한 식물종에서 보고되어 왔으며 기주 식물에 영향을 미치는 생물적, 비생물적 스트레스로부터 기주를 보호하는데 필수적인 역할을 담당한다. 이 연구는 차세대염기서열분석법으로 균류내 라이보좀 ITS2부위를 증폭하여 분석하는 Illumina MiSeq sequencing platform을 적용하여 참나무 시들음병에 감수성이 다른 2종의 참나무, 즉 신갈나무(Quercus mongolica)와 졸참나무(Quercus serrata)내에 존재하는 내생균류의 군집을 비교하였다. 총 230,768개의 시퀀스 리드(read)를 읽어서 97% 상동성 수준에서 클러스터링(clustering)을 하여 709개의 OUT로 구분하였다. 졸참나무와 신갈나무의 OUT수는 각각 617, 512으로 졸참나무가 다소 높았고, 다양성 지수인 Shannon지수도 졸참나무가 신갈나무보다 균류다양성이 유의적으로 높았다. 모든 OUT는 5문, 17강 60속 133과 195속 280종으로 분류되었고 이 중 자낭균문에 속하는 균류가 75.11%의 상대적 풍부도를 나타낸 반면, 담자균문은 5.28%로 확인되었다. 졸참나무에서는 Leptosillia, Aureobasidium, Acanthostigma 속이 가장 우점속으로 상대적인 풍부도가 각각 2.85, 2.76, 2.19%이었다. 한편 신갈나무에서는 Peltaster, Cladosporium, Monochaetia 속이 가장 우점속이었고 상대적인 풍부도는 각각 4.83, 3.03, 2.87%이었다. 이상의 결과에 의하면 2종의 참나무에서 내생균류 군집은 유의적으로 큰 차이가 있었고, 이러한 차이가 참나무 시들음병균(Raffaelea quercus-mongolicae)에 대한 감수성 차이에 영향을 미칠 수도 있을 가능성이 있다고 판단된다.
국내에서 R. quercus-mongolicae에 의한 참나무 시들음병이 2004년에 처음으로 보고되었고, 참나무 수종별, 부위별로 내생균류를 분리배양하여 확보한 368균주를 대상으로 참나무 시들음병균에 대한 길항효과를 대치배양법에 의해 검정하였다. 길항활성이 우수한 균주를 선발하여 액체배양하고 배양추출물을 각각 확보하여 병원균의 균사생장, 포자형성, 포자발아 억제활성을 검정한 결과, E089, E199, E282, E409, E415 등 5개 균주가 강한 억제활성을 나타내었다. 배양추출물을 가열한 경우에는 억제 활성이 감소한 결과를 나타내어 활성물질이 열에 약한 것으로 확인하였다. 병원균의 균사생장 억제활성이 강한 균주는 E409 (Colletotrichum acutatum), E089 (Daldinia childiae), E415 (Alternaria alternata), E199 (Daldinia childiae) 등이었고 이들의 억제율은 각각 79.0%, 70.1%, 68.9%, 64.5%이었다. 이들 균주는 포자형성 억제율도 각각 96.8%, 84.2%, 82.8%, 80.5%을 나타내어 포자형성 억제활성도 강한 것으로 확인되었다. 특히, 이들 균주 중에서E282 (Nectria balsamea) 균주는 배양추출물의 가열, 비가열에 상관없이 병원균의 포자발아를 완벽하게 억제하였다. 참나무 시들음병균에 억제활성을 나타내는 균주들은 다른 부위에 비해서 엽병에서 많이 분리되어 부위별 차이를 나타내었다.
이들 균주 중에서 3균주, 즉 E089 (D. childiae), E282 (N. balsamea), and E409 (C. acutatum)에 대해서는 배양기간을 달리하여 배양한 후 길항활성을 비교한 결과, 배양기간의 차이에 따라 병원균의 균사생장 억제활성에 큰 차이가 확인되었다. E089, E282, E409 균주를 3주간 배양하여 수확한 배양추출물은 2주간 배양한 추출물보다 균사생장억제율이 더욱 높았으며 각각 82.2%, 100%, 85.0%를 나타내었고, 포자형성 억제율도 각각 93.3%, 100%, 92.1%를 나타내었다. 포자발아 억제율에 있어서는 E409균주를 3주간 배양한 추출물이 2주간 배양추출물보다 낮았으나 E089균주는 반대로 3주간 배양한 추출물이 100%의 억제율을 나타내었다. 특히 E282균주는 배양기간에 상관없이 포자발아를 100% 억제하였으며, 3주간 배양추출물의 경우에는 포자발아 뿐만 아니라 균사생장, 포자형성까지 100% 억제하였다. E282균주의 배양추출물에 함유된 억제활성물질을 규명하기 위하여 용매를 달리하여 분획을 수확하여 분획별 활성을 검정한 결과, diethyl ether (Et2O)로 수확한 분획이 병원균의 균사생장과 포자형성을 완벽하게 억제하였으므로 이 물질은 추가연구를 통하여 향후 참나무 시들음병의 생물적 방제제로 개발가능한 유망한 물질로 기대된다.

Fungal endophytes have been recorded in various plant species with a richness of diversity, and their presence plays an essential role in host plant protection against biotic and abiotic stresses. This study applied the Illumina MiSeq sequencing platform based on the amplification of fungal ribosomal ITS2 region to analyze fungal endophytic communities of two oak species (Quercus mongolica and Quercus serrata) with different susceptibilities to oak wilt disease in Korea. The results showed a total of 230,768 sequencing reads were obtained and clustered at a 97% similarity threshold into 709 operational taxonomic units (OTUs). The OTUs of Q. serrata were higher than those of Q. mongolica with the number of 617 OTUs and 512 OTUs, respectively. Shannon index also showed that Q. serrata had a significantly higher level of fungal diversity than Q. mongolica. Total of OTUs were assigned into 5 fungal phyla, 17 classes, 60 orders, 133 families, 195 genera, and 280 species. Ascomycota was the dominant phylum with 75.11% relative abundance, followed by Basidiomycota with 5.28%. Leptosillia, Aureobasidium and Acanthostigma were the most abundant genera detected in Q. serrata with the average relative abundance of 2.85%, 2.76% and 2.19%, respectively. On the other hand, Peltaster, Cladosporium and Monochaetia were the most common genera detected in Q. mongolica with the average relative abundance of 4.83%, 3.03% and 2.87%, respectively. Our results indicated that fungal endophytic communities were significantly different between two oak species and these differences could influence responses of host trees to oak wilt disease caused by Raffaelea quercus-mongolicae.
Oak wilt disease caused by R. quercus-mongolicae has emerged obviously in Korea. We selected antifungal isolates against R. quercus-mongolicae among 368 endophytic fungal isolates from different parts of oak and pine trees. The experiment was conducted in the primary and secondary screenings by dual culture test. The antifungal activity of the selected isolates was assessed in culture filtrate test based on the inhibition rates in mycelial growth, sporulation, and spore germination of oak wilt fungus. Five isolates, E089, E199, E282, E409 and E415, showed strong antifungal activity in culture filtrate test, and their antifungal activity decreased on the culture media supplemented with heated culture filtrate. Higher mycelial growth inhibitions on the unheated media were recorded in E409 (Colletotrichum acutatum), E089 (Daldinia childiae), E415 (Alternaria alternata) and E199 (Daldinia childiae) with the inhibition rates of 79.0%, 70.1%, 68.9% and 64.5%, respectively. These isolates also had the higher sporulation inhibitions on unheated media with the rates of 96.8%, 84.2%, 82.8% and 80.5%, respectively. The spore germination of the oak wilt fungus was completely inhibited by E282 (Nectria balsamea) on both unheated and heated media. These results showed that a higher number of potent antifungal isolates against oak wilt fungus was isolated from the petiole compared to the other parts.
Three isolates, E089 (D. childiae), E282 (N. balsamea), and E409 (C. acutatum), were used to optimize their antifungal efficiency by comparing 2 different culture periods. Culture filtrates of these three isolates obtained from 2 different culture periods were amended with Potato Dextrose Agar (PDA) medium to evaluate antifungal activity against the oak wilt pathogen. Mycelial growth of R. quercus-mongolicae on PDA medium containing culture filtrates was significantly affected by culture periods of endophytic fungi. Culture filtrates of E089, E282, and E409 obtained after three weeks’ cultivation had higher mycelial growth inhibitions compared to those of 2 weeks with inhibition rates of 82.2%, 100%, and 85.0%, respectively. Culture filtrates of these isolates also showed higher sporulation inhibitions on PDA medium containing 3-week culture filtrates with the rates of 93.3%, 100%, and 92.1%, respectively. For spore germination of oak wilt fungus, only E409 had a lower inhibition rate on 3-week culture filtrate compared to that of 2 weeks while the opposite occurred for E089 with an inhibition rate of 100% on 3-week culture filtrate. Especially, spore germination inhibition rates of E282 reached 100% in both culture period conditions. These results showed that 3-week culture filtrate of N. balsamea E282 completely inhibited mycelial growth, sporulation, and spore germination of oak wilt fungus. The antifungal activities of its fractions against oak wilt fungus were significantly different. In which, diethyl ether (Et2O) fraction completely inhibited mycelial growth and sporulation of oak wilt fungus, and it could be developed as a potential biocontrol agent against R. quercus-mongolicae, the oak wilt pathogen of Q. mongolica.

#Antifungal activity #Biocontrol #Endophytic fungi #Fungal community #Illumina MiSeq #Metagenomic #Oak wilt disease #Quercus mongolica #Quercus serrata #Raffaelea quercus-mongolicae

Chapter I. General introduction 1
1.1. Diversity of endophytic fungi in forest trees 2
1.2. Application of endophytic fungi 5
1.2.1. Application of endophytes in the environment 5
1.2.2. Application of endophytes in energy 6
1.2.3. Application of endophytes in enzymes 7
1.2.4. Application of endophytes in biomedicine 8
1.2.5. Application of endophytes in agriculture 11
1.3. Oak wilt disease and management 12
1.4. Endophytic fungi in Korea 15
1.5. Study objectives and hypotheses 17
Chapter II. Fungal community analyses of endophytic fungi from two oak species, Quercus mongolica and Quercus serrata, in Korea 19
2.1. Abstract 20
2.2. Introduction 21
2.3. Materials and methods 23
2.3.1. Sampling collections 23
2.3.2. DNA extraction 24
2.3.3. ITS amplification and DNA library construction 24
2.3.4. Sequencing processing and taxonomical assignment 25
2.3.5. Statistical analysis and computations 25
2.4. Results 26
2.4.1. Fungal diversity and richness 26
2.4.2. Taxonomic assignment of endophytic fungi 29
2.5. Discussion 33
2.6. Conclusion 38
Chapter III. Screening of endophytic fungal isolates against Raffaelea quercus-mongolicae causing oak wilt disease in Korea 39
3.1. Abstract 40
3.2. Introduction 41
3.3. Materials and methods 42
3.3.1. Pairing test (Dual culture test) 42
3.3.2. Culture filtrate test 45
3.3.3. Statistical analysis 47
3.4. Results 47
3.4.1. Screening of endophytic fungal isolates with antifungal activity against R. quercus-mongolicae in dual culture test 47
3.4.2. Mycelial growth inhibition activity of the selected isolates against R. quercus-mongolicae in culture filtrate 49
3.4.3. Sporulation inhibition by the selected isolates 51
3.4.4. Spore germination inhibition by the selected isolates 52
3.5. Discussion 54
3.5.1. Endophytic fungi against oak wilt 54
3.5.2. The effect of heating on antifungal activity of culture filtrate from endophytic fungi 56
3.5.3. Isolation frequency of endophytic fungi with antifungal activity from different parts of host tree 57
3.6. Conclusion 58
Chapter IV. Antifungal activity of culture filtrate from endophytic fungus Nectria balsamea E282 and its fractions against R. quercus-mongolicae 59
4.1. Abstract 60
4.2. Introduction 61
4.3. Materials and methods 63
4.3.1. Preparation of culture filtrate and experimental design 63
4.3.2. Assessment of antifungal activity of culture filtrates against oak wilt fungus 63
4.3.3. Extraction and isolation of fractions from Nectria balsamea E282 64
4.3.4. Assessment of antifungal activity of fractions 65
4.3.5. Statistical analysis 66
4.4. Results 66
4.4.1. Mycelial growth of oak wilt fungus on culture filtrates 66
4.4.2. Inhibition activities of culture filtrates against oak with fungus 67
4.4.3. Inhibition activities of fractions from Nectria balsamea E282 against oak with fungus 71
4.5. Discussion 74
4.6. Conclusion 76
Chapter V. General discussion 77
5.1. The differences in endophytic fungal communities of two oak species 78
5.2. Potential of endophytic fungi for biocontrol against oak wilt disease 79
5.3. Conclusions and outlook 80
References 82
APPENDIX 107
Korean abstract 130

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