Role of Immunoglobulin-like Cell Adhesion Molecules in the Process of Muscle Formation :근육 형성과정에서 Immunoglobulin-like Cell Adhesion Molecules의 기능 연구

Lim, Jeong Ho

자료유형: 학위논문

저자정보: Lim, Jeong Ho (영남대학교, 영남대학교 대학원)

지도교수: 최인호

발행연도: 2022

저작권: 영남대학교 논문은 저작권에 의해 보호받습니다.

이용수7

초록· 키워드

근육위성세포(근육줄기세포)는 근육조직에 존재하는 줄기세포로써 근육의 발달과재생에 관여하며 근육형성에 관여하는 인자들(myoblast determination protein 1: MYOD, myogenin: MYOG, myogenic factor 5: MYF5 등)에 의해 근육세포로 분화한다. 그러나 근육위성세포가 근육 세포로 분화할 때 관여하는 세포막 부착 인자들의 작용기전은 명확하게 밝혀지지 않았다. 본 연구에서는 면역글로불린 단백질(immunoglobulin superfamily)의 일종이며, 세포부착분자(cell adhesion molecule)로 알려진 IgLON4와 5가 근육위성세포의 분화과정에서 어떠한 역할을 하는 지에 대해 자세히 연구하였다. IgLON4와 5 유전자는 마우스 유래 근아세포(C2C12)와 근육위성세포가 근육세포로 분화하는 과정 동안 발현이 증가하였다. IgLON4와 5 유전자 발현을 억제(knockdown) 시키거나 항체 처리(immunoneutralization)를 통하여 단백질을 억제하였을 경우 근관(myotube)의 형성과 근육발달 조절인자들(MYOD, MYOG, myosin)의 발현이 정상 세포에 비해 감소하였다. 특히 IgLON4와 5는 근아세포의 분화과정 동안 뚜렷한 기능 차이를 나타내었다. IgLON4의 경우 근아세포의 분화과정에서 세포-세포 부착부위에 지질뗏목의 축적을 촉진하고, 지질뗏목에 존재하는 구성 단백질 성분을 조절함으로써 근육다발과 유사하게 근관이 한쪽 방향으로 정렬하는 기능을 수행하는 것으로 확인되었으며, IgLON5는 근아세포의 분화 초기에 세포-세포 부착 기능을 담당함으로써 세포외기질(extracellular matrix: collagen type 1 alpha 1: COL1a1, fibromodulin: FMOD, dermatopontin: DPT, and thrombospondin 1: THBS1), 세포막 접착 단백질(cadherin 15: CDH15) 및 세포골격 리모델링 단백질(wiskott?Aldrich syndrome protein: WASP) 유전자의 발현을 조절함으로써 근아세포의 분화를 조절하는 것으로 관찰되었다. 손상된 근육의 재생과정 동안 IgLON4와 5의 발현을 관찰하기 위해 마우스근육에 cardiotoxin (CTX)를 처리하고 7일 동안 유지하였으며, IgLON4와 IgLON5 의 발현이 손상되지 않은 근육에 비해 재생 중인 근육에서 증가함을 관찰하였다. 본 연구는 지금까지 신경 발달 과정을 중심으로 연구되어온 IgLONs이 근육의 분화 과정뿐만 아니라 재생에 중요한 역할을 한다는 사실을 새롭게 밝혀냈으며, 향후 근육 관련 질병의 치료제 개발에 필요한 중요한 단서를 제공할 수 있을 것으로 판단된다.

Muscle satellite stem cells (MSCs) are a type of myogenic stem cells with the potential to be converted to muscle cells by the action of several myogenic regulatory factors (myoblast determination protein 1: MYOD, myogenin: MYOG, myogenic factor 5: MYF5, etc.). However, the mechanisms underlying the expression of cell membrane-bound adhesion factors in MSCs differentiation are still unknown. This study investigated into how immunoglobulin-like cell adhesion molecules 4 and 5 (IgLON4 and 5) play a role in the fate determination of myoblasts to mature muscle cells. IgLON4 and 5 are cell adhesion proteins that belong to the immunoglobulin superfamily and play important cellular adhesive functions in several cell types. IgLON4 and 5 expressions in mouse C2C12 myoblasts and primary MSCs increased during the early myogenic differentiation stage. To confirm IgLON4 or 5 functions during myogenic differentiation, C2C12 cells were knockdown; myotube formation and myogenic factors (MYOD, MYOG, and myosins) expression were decreased in knockdown cells compared to control cells. In addition, immunoneutralization with specific IgLON4 or IgLON5 antibodies was performed, and the results were similar to knockdown. The most important finding is that IgLON4 and 5 participate in myogenic differentiation in different ways. IgLON4 inhibition disrupts early myoblast alignment, lipid raft accumulation, and the expression of constituent proteins at the cell-cell adhesion site during myogenic differentiation. On the other hand, inhibition of IgLON5 decreased myoblast cell adhesion and gene expression of extracellular matrix (ECM) components (collagen type 1 alpha 1: COL1a1, fibromodulin: FMOD, dermatopontin: DPT, and thrombospondin 1: THBS1), cell membrane adhesion proteins (cadherin 15: CDH15), and cytoskeletal remodeling protein (wiskott?Aldrich syndrome protein: WASP). To investigate the expression of IgLON4 and 5 in muscle regeneration, cardiotoxin (CTX) was injected in mouse muscle and maintained for 7 days. IgLON4 and 5 genes expression were higher in CTX injected muscle tissues than in normal muscle tissues. In addition, IgLON4 expression was significantly increased during muscle development in the chicken embryo. In conclusion, this study on IgLON4 and IgLON5 reveals theirs involvement in myoblast differentiation and muscle regeneration by controlling cell orientation and adhesion, respectively, and contributes to the strategic development of therapeutics for muscular dystrophies.

Abstract 2
1. Introduction 4
2. Literature review 7
2.1 Skeletal muscle 7
2.2 Myogenesis and development 10
2.3 Muscle development regulators 11
2.4 Skeletal muscle regeneration and MSCs 13
2.5 Muscle degeneration 15
2.6 The role of the extracellular matrix constituting the muscle 16
2.7 FMOD 17
2.8 Immunoglobulin-like cell adhesion molecules, IgLON4 and IgLON5 18
2.9 Lipid rafts 23
3. Materials and Methods 25
3.1 Cell Culture 25
3.2 Immunoneutralization of IgLON4 and IgLON5 26
3.3 Gene knockdown 27
3.4 MTS assay 29
3.5 Cell adhesion force analysis using centrifugation 29
3.6 Animal experiment 30
3.7 Immunocytochemistry 30
3.8 Fusion indices 31
3.9 Total RNA extraction, cDNA synthesis, and real-time RT-PCR 32
3.10 Extraction of lipid rafts 35
3.11 Western blot analysis 35
3.12 Immunohistochemistry 36
3.13 Immunofluorescence 37
3.14 Statistical analysis 37
4. Results 38
4.1 Expression of IgLON family genes in C2C12 myoblasts 38
4.2 IgLON5 expression in myoblast differentiation 42
4.3 IgLON5 expression and myotube formation 46
4.4 The roles of IgLON5 during adhesion and proliferation 49
4.5 Gene expression profiles in Wt and IgLON5kd cells 52
4.6 IgLON5 expression during muscle regeneration 55
4.7 The adhesion function of IgLON5 with interaction of various factors in muscle differentiation and regeneration 58
4.8 IgLON4 expression in myoblast differentiation 60
4.9 Alignment functions of IgLON4 in myoblast differentiation 65
4.10 The regulation of lipid rafts accumulation of IgLON4 in muscle differentiation 69
4.11 Myogenic differentiation of myoblasts in aligned environments 76
4.12 IgLON4 expression in muscle regeneration 81
4.13 The adhesion and accumulation of lipid rafts of IgLON4 roles in myotube alignment 84
4.14 Effect of double knockdown of IgLON4 and IgLON5 on myoblast differentiation 88
4.15 Effects of IgLON4kd, IgLON5kd, and Dbkd in adhesion and proliferation on myoblasts 93
4.16 Effects of IgLON4kd, IgLON5kd, and Dbkd in adhesive force on myoblasts 96
4.17 Expression of myogenic markers and IgLON family genes in mouse primary MSCs 101
4.18 Expression of IgLON family in chicken primary MSCs 104
4.19 Expression of IgLON family in chicken embryonic muscle tissue 107
5. Discussion 116
6. References 123
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