Microfluidic platform towards the automation of bacterial preconcentration and DNA extraction in clinical samples :

Abdurhaman Teyib Abafogi

자료유형: 학위논문

저자정보: Abdurhaman Teyib Abafogi (성균관대학교, 성균관대학교 일반대학원)

지도교수: 박성수

발행연도: 2023

저작권: 성균관대학교 논문은 저작권에 의해 보호받습니다.

이용수12

초록· 키워드

패혈증은 주로 광범위한 박테리아 종에 의한 혈액 감염으로 인해 발생합니다. 패혈증을 신속하게 발견하고 적절한 치료를 통해 병원균을 중화하고 제어되지 않는 면역 반응을 중단시키지 않으면 패혈증으로 인한 사망률은 매시간 최대 10%까지 증가합니다. 병원균과 항생제에 대한 민감성을 신속하고 정확하게 식별하면 표적 치료를 통해 적시에 개입할 수 있는 길을 열어 사망률을 줄일 수 있습니다. 패혈증의 신속한 진단을 위해 PCR과 같은 유전자 증폭에 기반한 분자진단이 이용되어 왔다. 그러나 혈액에는 heme, leukocyte DNA와 같은 억제 화합물과 EDTA, heparin과 같은 항응고제가 존재하기 때문에 혈액에 직접 PCR을 수행할 수 없습니다.
고체상 DNA 추출 기술과 같은 샘플 준비 기술이 억제 화합물 제거에 사용되었습니다. 가장 널리 사용되는 DNA 추출 방법이지만 부피가 200 µL로 낮아 박테리아 농도가 매우 낮은 시료에서 DNA를 추출하는 능력이 제한적입니다. 샘플 준비 중에 자성 실리카 비드는 억제 화합물로 쉽게 오염될 수 있습니다.
이 문제를 해결하기 위해 항체가 결합된 초상자성 나노입자(MNP)를 사용하고 이를 3D 인쇄 미세유체 장치와 통합하여 대용량 샘플에서 높은 유속으로 박테리아를 사전 농축했습니다. 그리고 억제 화합물로 MSB 오염을 줄이기 위해 별도의 원추형 마이크로 챔버에서 박테리아로부터 DNA 추출. 플랫폼을 사용하여 대장균 O157:H7의 검출 한계가 10 CFU/mL로 감소했습니다. 그러나 SiO2로 코팅된 자성나노입자의 사용으로 인해 혈액에서 Ab-MNPs의 응집이 일어나 DNA 추출에 어려움이 있었다. 패혈증은 여러 종류의 박테리아에 의해 발생하지만 항체를 사용하면 한 종류의 박테리아만 포획되어 패혈증 검출에 사용하는 것이 비현실적입니다. 이러한 문제를 개선하기 위해 PDA, PEG와 같은 강한 친수성 고분자 코팅으로 코팅된 나노입자를 합성하여 혈액 내 나노입자 뭉침 현상을 제거하였습니다. 그리고 그람 양성 박테리아의 펩티도글리칸 층에 결합하는 정균 항생제 반코마이신과 그람 음성 박테리아의 리포다당류와 수소 결합을 형성하는 알란토인과 같은 분자의 결합으로 두 가지 그램-양성 박테리아를 미리 농축할 수 있었습니다. 응집이 없는 혈액 내 양성 및 그람 음성 박테리아. IMS 및 DNA 추출에 의한 박테리아의 사전 농축은 여러 단계를 거쳐야 하므로 수동으로 수행하는 것이 번거롭습니다. 그래서 저는 박테리아의 사전 농축과 혈액에서 박테리아의 DNA 추출을 위한 자동 샘플 준비 시스템을 개발했습니다. 이 장치를 사용하여 혈액에서 항생제 내성 슈퍼버그를 포함하여 9종의 박테리아를 사전 농축할 수 있었습니다. 그 결과 PCR과 qPCR을 이용하여 각 세균을 102 CFU/mL까지 검출할 수 있었습니다. 그리고 그람 양성균과 음성균에 감염된 환자 샘플에서 박테리아를 성공적으로 검출했습니다.
1장에서는 패혈증, 패혈증의 정의, 현재 사용되는 진단 방법 및 단점에 대해 제시합니다. 분자 진단을 개선하기 위한 박테리아의 면역자기 분리 가능성에 대해 논의합니다. 패혈증의 자동진단을 위한 자동진단시스템의 필요성과 미세유체장치의 장점. 마지막으로 3D 프린팅 미세유체공학의 장점입니다.
2장에서는 W자형 채널과 통합 밸브로 분리된 마이크로 챔버로 구성된 3D 인쇄 모듈식 미세유체 장치의 사용에 대해 설명합니다. W자 형태의 채널은 박테리아 포획 효율을 높이기 위해 사용되며, 별도의 마이크로 채널은 별도의 채널과 마이크로 챔버를 사용하여 자성 실리카 비드의 오염을 줄여 고품질의 DNA 추출이 가능합니다.
3장에서는 현재 사용되는 MNP가 혈구 및 혈소판과 상호작용하여 응집을 일으키는 경향과 반코마이신 결합 폴리도파민 코팅 철 나노입자를 사용하여 응집 제거 및 분자진단의 개선에 대해 논의하였다.
4장에서는 수혈 전에 오염된 혈액을 신속하게 감지하는 방법을 제시합니다. 반코마이신 및 알란토인과 접합된 폴리에틸렌 글리콜(PEG)로 코팅된 MNP는 분자 진단을 개선하기 위해 그람 양성 및 그람 음성 박테리아를 포획하는 데 사용되었습니다.
5장에서는 자동화 시스템의 설계와 반코마이신/알란토인 결합 폴리도파민 코팅 MNP와의 통합을 설명하여 임상 샘플에서 병원균의 분자 검출을 개선하기 위한 박테리아 농축 및 DNA 추출을 수행합니다.

Sepsis is caused mainly by infection in the blood with a broad range of bacterial species. Unless sepsis is detected quickly and appropriate treatment is applied to neutralize pathogens and stop the uncontrolled immune response, mortality from sepsis increases by up to 10% for every hour. Quick and accurate identification of the pathogen and its susceptibility to antibiotics paves the way for timely intervention through targeted therapy, thereby reducing mortality. Molecular diagnosis based on gene amplification, such as PCR, has been used for the rapid diagnostics of sepsis. However, due to the presence of inhibitory compounds such as heme, leukocyte DNA, and anticoagulants such as EDTA and heparin in the blood, PCR cannot be performed directly on the blood.
Sample preparation techniques, such as solid-phase DNA extraction techniques, have been used for the removal of inhibitory compounds. Although it is the most widely used DNA extraction method, due to its low volume capacity (200 µL), its ability to extract DNA from a sample with a very low concentration of bacteria is limited. During sample preparation, magnetic silica beads can be easily contaminated with inhibitory compounds.
To solve this problem, I used antibody-conjugated superparamagnetic nanoparticles (MNPs) and integrated them with a 3D-printed microfluidic device to preconcentrate bacteria from a large-volume sample at a high flow rate. And DNA extraction from bacteria in a separate conical microchamber to reduce MSB contamination with inhibitory compounds. With the use of the platform, the detection limit of Escherichia coli O157:H7 was reduced to 10 CFU/mL. However, due to the use of SiO2-coated magnetic nanoparticles, aggregation of Ab-MNPs occurred in the blood, leading to difficulties in DNA extraction. Sepsis is caused by several species of bacteria, whereas with the use of antibodies, only one type of bacteria was captured, making their use for sepsis detection unrealistic. To ameliorate these problems, I synthesized nanoparticles coated with a strong hydrophilic polymer coating, such as PDA and PEG, to eliminate nanoparticle aggregation in blood. And with the conjugation of bacteriostatic antibiotic vancomycin, which binds to the peptidoglycan layer of Gram-positive bacteria, and molecules like Allantoin, which form a hydrogen bond with the lipopolysaccharides of Gram-negative bacteria, I was able to pre-concentrate both Gram-positive and Gram-negative bacteria in blood without aggregation. The preconcentration of bacteria by IMS and DNA extraction must follow several steps, which makes it cumbersome to do it manually. Thus, I have developed an automated sample preparation system for the pre-concentration of bacteria and the extraction of their DNA from blood. With this device, I was able to preconcentrate 9 species of bacteria, including antibiotic-resistant superbugs from the blood. As a result, I was able to detect as low as 102 CFU/mL of each bacterium with the use of PCR and qPCR. And I have successfully detected bacteria from patient samples infected with Gram-positive and negative bacteria.
Chapter 1 presents about sepsis, the definition of sepsis, the diagnostic methods currently used and their drawbacks. Discusses the promise of Immunomagnetic separation of bacteria to improve molecular diagnostics. The need for automated diagnostic systems and the advantages of the microfluidic device for the automated diagnosis of sepsis. And finally, the advantage of 3D printed microfluidics.
Chapter 2 discusses the use of a 3D printed modular microfluidic device composed of a W-shaped channel and a micro chamber separated by an integrated valve. The W-shaped channel is used to increase bacteria capture efficiency and the separate microchannel allows for high-quality DNA extraction due to reduced contamination of the magnetic silica beads by using separate channels and micro chamber.
In chapter 3, the tendency of currently used MNPs to interact with blood cells and platelets causing aggregation was discussed and the elimination of aggregation with the use of vancomycin-conjugated polydopamine-coated iron nanoparticles and the improvement of the molecular diagnosis.
Chapter 4 presents the rapid detection of contaminated blood before transfusion. Polyethylene glycol (PEG)-coated MNPs conjugated with vancomycin and Allantoin was used to capture Gram-positive and Gram-negative bacteria to improve molecular diagnosis.
Chapter 5 describes the design of the automated system and its integration with vancomycin/Allantoin-conjugated polydopamine-coated MNPs for bacterial enrichment and DNA extraction to improve molecular detection of pathogens in clinical samples.

#Sepsis #Molecular diagnostics #Sample preparation #Microfluidic device #Automated system #Immunomagnetic separation #Preconcentration #Polydopamine #Polyethylene glycol #Vancomycin #Allantoin

Sepsis is caused mainly by infection in the blood with a broad range of bacterial species. Unless sepsis is detected quickly and appropriate treatment is applied to neutralize pathogens and stop the uncontrolled immune response, mortality from sepsis increases by up to 10% for every hour. Quick and accurate identification of the pathogen and its susceptibility to antibiotics paves the way for timely intervention through targeted therapy, thereby reducing mortality. Molecular diagnosis based on gene amplification, such as PCR, has been used for the rapid diagnostics of sepsis. However, due to the presence of inhibitory compounds such as heme, leukocyte DNA, and anticoagulants such as EDTA and heparin in the blood, PCR cannot be performed directly on the blood.
Sample preparation techniques, such as solid-phase DNA extraction techniques, have been used for the removal of inhibitory compounds. Although it is the most widely used DNA extraction method, due to its low volume capacity (200 µL), its ability to extract DNA from a sample with a very low concentration of bacteria is limited. During sample preparation, magnetic silica beads can be easily contaminated with inhibitory compounds.
To solve this problem, I used antibody-conjugated superparamagnetic nanoparticles (MNPs) and integrated them with a 3D-printed microfluidic device to preconcentrate bacteria from a large-volume sample at a high flow rate. And DNA extraction from bacteria in a separate conical microchamber to reduce MSB contamination with inhibitory compounds. With the use of the platform, the detection limit of Escherichia coli O157:H7 was reduced to 10 CFU/mL. However, due to the use of SiO2-coated magnetic nanoparticles, aggregation of Ab-MNPs occurred in the blood, leading to difficulties in DNA extraction. Sepsis is caused by several species of bacteria, whereas with the use of antibodies, only one type of bacteria was captured, making their use for sepsis detection unrealistic. To ameliorate these problems, I synthesized nanoparticles coated with a strong hydrophilic polymer coating, such as PDA and PEG, to eliminate nanoparticle aggregation in blood. And with the conjugation of bacteriostatic antibiotic vancomycin, which binds to the peptidoglycan layer of Gram-positive bacteria, and molecules like Allantoin, which form a hydrogen bond with the lipopolysaccharides of Gram-negative bacteria, I was able to pre-concentrate both Gram-positive and Gram-negative bacteria in blood without aggregation. The preconcentration of bacteria by IMS and DNA extraction must follow several steps, which makes it cumbersome to do it manually. Thus, I have developed an automated sample preparation system for the pre-concentration of bacteria and the extraction of their DNA from blood. With this device, I was able to preconcentrate 9 species of bacteria, including antibiotic-resistant superbugs from the blood. As a result, I was able to detect as low as 102 CFU/mL of each bacterium with the use of PCR and qPCR. And I have successfully detected bacteria from patient samples infected with Gram-positive and negative bacteria.
Chapter 1 presents about sepsis, the definition of sepsis, the diagnostic methods currently used and their drawbacks. Discusses the promise of Immunomagnetic separation of bacteria to improve molecular diagnostics. The need for automated diagnostic systems and the advantages of the microfluidic device for the automated diagnosis of sepsis. And finally, the advantage of 3D printed microfluidics.
Chapter 2 discusses the use of a 3D printed modular microfluidic device composed of a W-shaped channel and a micro chamber separated by an integrated valve. The W-shaped channel is used to increase bacteria capture efficiency and the separate microchannel allows for high-quality DNA extraction due to reduced contamination of the magnetic silica beads by using separate channels and micro chamber.
In chapter 3, the tendency of currently used MNPs to interact with blood cells and platelets causing aggregation was discussed and the elimination of aggregation with the use of vancomycin-conjugated polydopamine-coated iron nanoparticles and the improvement of the molecular diagnosis.
Chapter 4 presents the rapid detection of contaminated blood before transfusion. Polyethylene glycol (PEG)-coated MNPs conjugated with vancomycin and Allantoin was used to capture Gram-positive and Gram-negative bacteria to improve molecular diagnosis.
Chapter 5 describes the design of the automated system and its integration with vancomycin/Allantoin-conjugated polydopamine-coated MNPs for bacterial enrichment and DNA extraction to improve molecular detection of pathogens in clinical samples

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