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논문 기본 정보
- 자료유형
- 학위논문
- 저자정보
- 지도교수
- 서수련
- 발행연도
- 2024
- 저작권
- 강원대학교 논문은 저작권에 의해 보호받습니다.
이용수2
초록· 키워드
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Regulator of calcineurin 1 (RCAN1)은 calcium/calmodulin-dependent protein phosphatase인 calcineurin과 결합하는 단백질이다. 선행연구에서 Rcan1(-/-) 마우스에 인플루엔자 A/PR/8를 감염시켜 바이러스에 의한 면역반응 분석을 통해 확인해본 결과 Rcan1(-/-) mouse의 생존율의 현저한 감소 및 폐 조직에서의 과도한 염증과 손상이 확인되었다. 따라서, RCAN1은 생체내에 다양한 면역반응에 참여하는 조절자로 기능할 것으로 사료되어 본 연구를 수행하게 되었다.
면역 세포사멸 분야에서 현재 많은 연구가 진행중인 necroptosis는 tumor necrosis factor-α (TNF-α) 신호전달기전을 통해 진행되는 용해성 세포 사멸로서 receptor-interacting serine/threonine-protein kinase 1 (RIPK1)/receptor-interacting serine/threonine-protein kinase 3 (RIPK3)/mixed lineage kinase domain like pseudokinase (MLKL) signaling cascade에 의해 이루어진다. 인산화된 MLKL은 다량체를 이루어 세포막에 구멍을 직접 형성하고 세포 내에 있는 다량의 염증성 사이토카인 또는 손상 연관 분자유형 (damage-associated molecular patterns, DAMPs)이 방출시킨다. 따라서, 조절되지 못한 necroptosis는 세포에 심각한 염증반응 뿐만 아니라 조직의 괴사를 통해 만성 염증성 질환을 유발하는 것으로 알려져 있다.
본 연구에서는, RCAN1과 RIPK1의 결합을 면역 침강법 (immunoprecipitation, IP)를 통해 확인하였으며, 결합된 RCAN1이 RIPK1에 의해 인산화 되는 것을 관찰하였다. 이어서, RCAN1의 결합 아미노산 서열을 찾기 위해 RCAN1 fragment를 제작하여 RCAN의 30 – 90 도메인에 결합되는 것을 알아냈다. Necroptosis 수준을 파악할 수 있는 MLKL 인산화에 RCAN1의 영향을 확인하고자 RCAN1을 안정적으로 과발현 하도록 제작된 세포주를 제작하였다. 그 결과 RCAN1이 과발현되는 세포주는 MLKL의 인산화가 현저히 감소한 것을 확인하였고, 추가로 실제 동물 면역세포에서 RCAN1이 necroptosis 억제를 통한 염증조절 효과를 확인하기위해 Rcan1(-/-) 마우스의 골수 유래 대식세포 (bone marrow derived macrophage, BMDM) BMDM을 사용하였다. 그 결과 앞서 나열한 결과를 뒷받침할 수 있는 MLKL의 인산화 증가를 Rcan1(-/-) BMDM에서 확인할 수 있으며, 염증성 사이토카인 Interleukin-1β (IL-1β)의 분비가 증가한 것까지 관찰되었다.
결론적으로 이 연구는 RCAN1이 necroptosis 개시 단백질 RIPK1과 결합하여 인산화가 진행되어 MLKL의 인산화 억제를 통해 과조한 염증반응과 조직의 괴사를 감소시킬 수 있는 새로운 조절자임을 확인할 수 있었다.
면역 세포사멸 분야에서 현재 많은 연구가 진행중인 necroptosis는 tumor necrosis factor-α (TNF-α) 신호전달기전을 통해 진행되는 용해성 세포 사멸로서 receptor-interacting serine/threonine-protein kinase 1 (RIPK1)/receptor-interacting serine/threonine-protein kinase 3 (RIPK3)/mixed lineage kinase domain like pseudokinase (MLKL) signaling cascade에 의해 이루어진다. 인산화된 MLKL은 다량체를 이루어 세포막에 구멍을 직접 형성하고 세포 내에 있는 다량의 염증성 사이토카인 또는 손상 연관 분자유형 (damage-associated molecular patterns, DAMPs)이 방출시킨다. 따라서, 조절되지 못한 necroptosis는 세포에 심각한 염증반응 뿐만 아니라 조직의 괴사를 통해 만성 염증성 질환을 유발하는 것으로 알려져 있다.
본 연구에서는, RCAN1과 RIPK1의 결합을 면역 침강법 (immunoprecipitation, IP)를 통해 확인하였으며, 결합된 RCAN1이 RIPK1에 의해 인산화 되는 것을 관찰하였다. 이어서, RCAN1의 결합 아미노산 서열을 찾기 위해 RCAN1 fragment를 제작하여 RCAN의 30 – 90 도메인에 결합되는 것을 알아냈다. Necroptosis 수준을 파악할 수 있는 MLKL 인산화에 RCAN1의 영향을 확인하고자 RCAN1을 안정적으로 과발현 하도록 제작된 세포주를 제작하였다. 그 결과 RCAN1이 과발현되는 세포주는 MLKL의 인산화가 현저히 감소한 것을 확인하였고, 추가로 실제 동물 면역세포에서 RCAN1이 necroptosis 억제를 통한 염증조절 효과를 확인하기위해 Rcan1(-/-) 마우스의 골수 유래 대식세포 (bone marrow derived macrophage, BMDM) BMDM을 사용하였다. 그 결과 앞서 나열한 결과를 뒷받침할 수 있는 MLKL의 인산화 증가를 Rcan1(-/-) BMDM에서 확인할 수 있으며, 염증성 사이토카인 Interleukin-1β (IL-1β)의 분비가 증가한 것까지 관찰되었다.
결론적으로 이 연구는 RCAN1이 necroptosis 개시 단백질 RIPK1과 결합하여 인산화가 진행되어 MLKL의 인산화 억제를 통해 과조한 염증반응과 조직의 괴사를 감소시킬 수 있는 새로운 조절자임을 확인할 수 있었다.
목차
- I. 서 론 1II. 실험방법 41. 실험 재료 42. 세포 배양과 형질 주입 53. Western blot analysis 54. Immunoprecipitation (IP) analysis 65. Protein phosphorylation analysis with Phos-tagTM SDS-PAGE 66. Generation of Stable Cell Lines TC-1 7III. 결과 81. Necroptotic 유도 과정에서 RCAN1 과 RIPK1 이 결합한다 82. RIPK1 이 RCAN1 을 기질로 하여 인산화 시킨다 103. RIPK1 은 RCAN1 의 30-90 아미노산 서열에 결합한다 124. RCAN1 은 necroptosis 필수 단백질인 MLKL 의 인산화를 억제한다 155. RCAN1 과발현 세포주에서 necroptosis 가 억제된다 186. Necroptosis 와 염증성 사이토카인은 Rcan1(-/-) BMDM 에서 증가되었다 217. RIPK1 으로부터 인산화 된 RCAN1 의 necroptosis 조절 기전 모식도 25IV. 논의 27V. 참고문헌 30영문 초록 33
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