Development of exosome-mimetic lipid nanocarrier for biomedical applications :생의약적 응용을 위한 엑소좀 유사 나노 지질전달체 개발

Kim, So-Yun

자료유형: 학위논문

저자정보: Kim, So-Yun (인제대학교, 인제대학교 일반대학원)

지도교수: 김성태

발행연도: 2024

저작권: 인제대학교 논문은 저작권에 의해 보호받습니다.

이용수27

초록· 키워드

본 연구에서는 유방암 치료에 사용되는 독소루비신을 탑재한 엑소좀 유사 나노 지질 전달체 개발을 목적으로 진행하였다. 엑소좀은 세포에 의해 분비되는 자연적인 나노 크기의 소포이며 세포 표면 분자를 운반하기 때문에, 자연적인 표적화뿐만 아니라 장기 조직 간에 관통 능력이 높다. 이러한 특성을 지녀 약물전달체로써 유망함에도 불구하고 낮은 생산 및 낮은 분리 수율, 약물 적재에 어려움을 가지고 있다. 지질 기반의 나노 캐리어로 많이 쓰이는 리포좀과 엑소좀을 융합시켜 이러한 문제점을 해결하고자 하였다. 리포좀은 친유성 및 친수성의 성질을 지녀 다양한 약물 포접이 가능하고 생체적합성, 변형이 가능한 물리화학적 및 생물화학적 특성으로 제어가 용의하여 제약 응용 분야에서 널리 쓰여왔다. 이러한 특성을 가진 리포좀과 엑소좀을 융합한 형태로 제형화하였다. 엑소좀과 리포좀의 비율을 다르게 하여 하이브리드 제형을 제조하였다. 익스트루더를 이용하여 제형을 제조하였으며 리포좀 수화 시 엑소좀과 독소루비신을 함께 수화시켜주었다. 제조된 하이브리드 제형은 약 100 nm 크기의 사이즈, 음수 제타 전위 값을 나타내었으며 독소루비신의 포접량을 분석하였다. 제조된 제형은 생리식염수, 혈청 내에서 사이즈가 안정한 것을 확인하였으며 트리톤 X-100 내에서의 제형의 분해를 확인한 결과 F3와 F4 제형이 안정하다는 것을 확인하였다. 세포 독성 결과, MCF-7 세포에서 비교적 높은 약물 효능을 보여 높은 독성을 확인하였다. 반면 MDA-MB-231와 MDA-MB-468 세포에서는 제형간의 세포 독성 차이를 확인하지 못하였다. 또한 4 ℃에서 제형을 처리한 결과 하이브리드 제형은 ATP를 이용한 경로와 관련이 있을 것이라 판단된다. 공초점 현미경을 통해 다른 세포와 비교하여 MCF-7 세포에 하이브리드 제형을 처리한 것이 핵과 약물이 더 겹쳐있는 것을 확인하였으며 NBD-PC와 lysotracker가 겹쳐있는 것을 미루어 보아 세포 내 이입임을 확인하였다.

The purpose of this study was to develop an exosome-mimetic nanolipid carrier loaded with doxorubicin, which is used to treat breast cancer. Exosomes are natural nano-sized vesicles secreted by cells and carry cell surface molecules, so they have a high ability to penetrate between organ tissues as well as natural targeting. Although it has these promising characteristics as a drug delivery carrier, it has low production, low isolation yield, and difficulty in drug loading. We attempted to solve this problem by fusing liposomes and exosomes, which are widely used as lipid-based nanocarriers. Liposomes have hydrophilic and hydrophilic properties, enabling encapsulation of various drugs, and have been widely used in pharmaceutical applications because they are biocompatible and easily controllable due to their physicochemical and biochemical properties that are easily modified. It was formulated as a fusion of liposome and exosome with these characteristics. Hybrid formulations were prepared by varying the ratio of exosomes and liposomes. The formulation was prepared using an extruder, with exosomes and drug being co-hydrated during liposome formation. The hybrid formulations exhibited characteristics such as a size of approximately 100 nm, a negative zeta potential, and the analysis of drug content. The hybrid formulations were confirmed to maintain stability in size in physiological saline and cell culuture. Triton X-100 decomposition tests revealed the stability of the F3 and F4 formulations. Cytotoxicity results revealed relatively high drug efficacy and confirmed high toxicity in MCF-7 cells. On the other hand, no difference in cytotoxicity between formulations was confirmed in other cells. Furthermore, the results of cell viability at 4°C suggested that cellular uptake of all formulations might be associated with an ATP-dependent pathway. Confocal microscopy confirmed that MCF-7 cells treated with the hybrid formulation exhibited greater colocalization between nuclei and drug compared to other cells. Additionally, the colocalization of NBD-PC and lysotracker confirmed intracellular endocytosis effect.

#Exosome #Liposome #Doxorubicin #Hybrid #Nanolipid carrier

국문초록
Abstract
List of Abbreviations
List of Tables
List of Figures
I Introduction 1
II Purpose 4
III Materials & Methods 5
1. Materials 5
2. Cell lines and culture 6
3. Fabrication of hybrid formulations 7
3.1. Isolation exosome 7
3.2. Preparation of liposome 8
3.3. Preparation of hybrid formulations with DOX 9
4. Entrapment efficiency 10
5. Physicochemical characterization 11
5.1. Size and zeta potential determination 11
5.2. Physical stability 11
5.3. Protein quantification of exosome 12
5.4. Morphology of formulations 12
6. In vitro experiment of hybrid formulations with DOX 13
6.1. Cell viability 13
6.2. Cell toxicity 13
6.3. Cellular uptake 14
IV Results & Discussion 15
1. Characterization of exosome 15
2. Characterization of hybrid formulation loading drug 17
2.1. Size, zeta potential and encapsulation efficiency 17
2.2. Physical stability 23
3. In vitro experiment of hybrid formulations with DOX 29
3.1. Cell viability 29
3.2. Cell toxicity 36
3.3. Cellular internalization 40
V Conclusions 44
VI References 45

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