R-point regulation에서 BRD4의 역할 :The role of BRD4 in R-point regulation

한상현

자료유형: 학위논문

저자정보: 한상현 (충북대학교, 충북대학교 일반대학원)

지도교수: 배석철

발행연도: 2024

저작권: 충북대학교 논문은 저작권에 의해 보호받습니다.

이용수2

초록· 키워드

cell cycle는 세포가 성장하고 분열할 때 세포에서 일어나는 필수적인 현상입 니다. cell cycle의 G1 단계에서 세포는 특정 신호에 대한 자극을 받아들이고 r estriction (R)-point을 결정을 내리는 과정을 거쳐간다. restriction (R)-point 메커니즘은 정상적인 분화, 세포사멸 및 G1–S기의 cell cycle에서 필수적인 요인이다. 또한 restriction (R)-point의 정상적인 작동여부가 종양 형성과 현 저하게 연관되어 있다. 따라서 restriction (R)-point을 이루는 분자 메커니즘 을 식별하는 것은 종양 생물학의 근본적인 문제 중 하나이다. (R)-point 결정에 중추적인 역할을 하고 종양 억제인자로 기능하는 RUNX3 은 위암과 폐암을 비롯한 다양한 유형의 인간 암에서 자주 비활성화된다. 이 러한 결과는 Runx3 삭제 후 세포가 종양 형성 활성을 획득한다는 것을 보고 되어져 있지만 RUNX3 메커니즘은 여전히 불분명했다. 또한 BET(Bromodom ain and Extraterminal) 단백질 계열의 구성원인 BRD4는 SE(super-enhancer) 으로서 조직 및 종양유전자 발현 조절에서의 역할로 암에서 널리 알려져 있 다. 암세포 내에서의 BRD4의 억제는 세포 성장의 억제와 SE 기능의 억제로 작용하여 암세포의 증식을 막을 수 있다는 것에 초점이 맞추어져 있었다. 그 러나 최근 증거에 따르면 암에서의 BRD4 관련성은 전사 조절에서의 역할을 넘어 이 단백질이 게놈 안정성을 유지하는 역할을 한다는 사실이 밝혀졌다. 우리는 (R)-point 결정에 중추적인 역할을 하고 종양 억제인자로 기능하는 R UNX3 역할에 BRD2(bromodomain-containing protein2) 와 BRD4(bromodoma in-containing protein4)가 필요하다는 것을 발견했다. 우리는 전부는 아니지만 in vitro 상황에서 Analysis of BRD2/BRD4 conditional knockdown을 통하여 RUNX3/p300/BRD2/BRD4 complex가 순차적으로 만들어지는지 확인을 하였 으며 in vivo 상황에서 tumor의 억제에 RUNX3/BRD4의 필요성을 증명하였 다. 그리하여 우리는 유사 분열 자극 후 초기에 RUNX3가 표적 유전자에 결 합하여 RUNX3/p300/BRD2/BRD4 complex 형성하고 이러한 complex형성과정 을 통하여 세포 스스로 세포의 증식 및 사멸의 결정 여부를 판단하는 것을 발 견하였다. 따라서 RUNX3가 종양에서의 restriction (R)-point 방어 메커니즘 이 RUNX3/p300/BRD2/BRD4 complex형성를 통하여 작동하는 것을 확인하였 으며 RUNX3/BRD2/BRD4 존재여부로 이러한 complex가 형성되지 않았을 때 방어 메커니즘이 작동하지 않는 것 또한 확인하였다. 핵심용어 : RUNX3, R-point, p300, BRD2, BRD4

The cell cycle is a fundamental phenomenon occurring in cells during growth and division. A critical phase within this cycle is the G1 phase, where cells respond to specific signals and determine the restriction (R)-point, a vital factor in normal differentiation, apoptosis, and the G1-S transition of the cell cycle. Importantly, the proper functioning of the R-point is closely associated with tumor formation, making the identification of its underlying molecular mechanisms a fundamental issue in tumor biology. RUNX3, a pivotal tumor suppressor and central player in R-point decisions, is often inactivated in various human cancers, including gastric and lung cancer. This inactivation leads to cells acquiring tumorigenic capabilities upon deletion of Runx3, although the mechanisms of RUNX3 have remained unclear. Additionally, members of the Bromodomain and Extraterminal (BET) protein family, particularly BRD4, are known for their roles in cancer, extending beyond transcriptional regulation to maintaining genomic stability. In our study, we discovered that the roles of BRD2 (bromodomain-containing protein2) and BRD4 (bromodomain-containing protein4) are necessary for the function of RUNX3 as a tumor suppressor and key regulator of the R-point decision. Through an analysis of BRD2/BRD4 conditional knockdown in vitro, albeit not exhaustive, we observed the sequential formation of a RUNX3/p300/BRD2/BRD4 complex. Moreover, in vivo experiments demonstrated the necessity of RUNX3/BRD4 for tumor suppression. We found that early after mitogenic stimulation, RUNX3 binds to target genes, forming the RUNX3/p300/BRD2/BRD4 complex. This complex formation enables cells to autonomously decide their fate in terms of proliferation or apoptosis. Consequently, our findings confirm that the tumor suppression mechanism at the R-point operates through the formation of the RUNX3/p300/BRD2/BRD4 complex. Furthermore, we established that when this complex fails to form due to the absence of RUNX3/BRD2/BRD4, the defense mechanism is compromised. These insights not only elucidate the molecular intricacies of the R-point but also open avenues for targeted therapies in cancers associated with RUNX3 and BRD-related pathways. Key Words : RUNX3, R-point, p300, BRD2, BRD4

#RUNX3 #BRD2 #BRD4

Abstract iV
List of figures Viii
List of table x
Ⅰ. Introduction ·1
Ⅱ. Materials and Methods 4
1. Cell lines and culture 4
2. DNA transfection, IP, and IB 4
3. Antibodies 5
4. Proximity ligation assay (PLA) ·6
5. ChIP assay 6
6. siRNA 7
7. Flow cytometry assay ·7
8. RNA sequencing 8
9. Quantification and statistical analysis 8
10. Data and software availability 9
11. Mice 9
Ⅲ. Results 10
1. Identification of Relationship Between the Restriction Point Complex R
UNX3,BRD2 and BRD4 ·10
2. Identifying the Relationship Between the Restriction Point Complex R
UNX3/BRD2 and BRD4 12
3. Relationship between RUNX3/BRD2/BRD4 Complex Formation and A
RF 14
4. Identification of the Mechanisms Behind RUNX3/BRD2/BRD4 Comple
x Formation and Its Impact on ARF and p53 Expression in H460 Lun
g Cancer Cells. ·16
5. Identification of the Role of RUNX3 and BRD4 in Inhibiting Lung Ca
ncer Cells through In Vivo Xenograft Experiments. 19
Ⅳ. Discussion 45
Ⅴ. References 47

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