밀웜(Tenebrio molitor) 단백가수분해물의 소태아혈청 대체 효과 및 이화학적 특성 :Fetal bovine serum substitution and physicochemical properties of mealworm (Tenebrio molitor) protein hydrolysate

윤현지

자료유형: 학위논문

저자정보: 윤현지 (계명대학교, 계명대학교 대학원)

지도교수: 이승욱

발행연도: 2024

저작권: 계명대학교 논문은 저작권에 의해 보호받습니다.

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초록· 키워드

소 태아 혈청(FBS)은 다른 동물 혈청 대비 글로불린 함량이 낮고 성장인자가 풍부하여 세포 배양 배지 제조 시 가장 널리 사용되는 보충제이다. 세포 배양 기술의 응용이 항체 생산, 줄기세포 치료, 재조합 단백질 생산, 안전성 평가, 질병 진단, 배양육 생산 등 다양한 생명과학 및 의학 연구 그리고 이와 관련된 산업으로 확대되면서 전 세계적으로 FBS의 사용량은 매년 꾸준히 증가하고 있다. 그러나 FBS의 생산 과정은 비윤리적이고 비용이 많이 들며 환경 문제와 혈액 수집 중 내독소, 마이코플라스마, 바이러스 및 프리온과 같은 오염 물질의 가능성을 포함한 여러 문제점을 안고 있다. 이러한 문제점들로 인해 세포 배양용 FBS에 대한 대체 원료를 발굴하고 대체재를 개발하려는 연구가 최근 관심을 받으며 활발히 진행되고 있다. 이와 같은 요구에 발맞춰 우리는 풍부한 영양소와 함께 세포 성장에 필수적인 아미노산을 다양하고 풍부하게 함유하고 산화 스트레스로 인한 세포 독성으로부터 세포를 보호하는 효과가 있다고 알려진 밀웜(Tenebrio molitor)이 FBS를 대체할 가능성이 있다고 가설을 세운 후, 거저리 단백질 가수분해물(TAH)을 제조하고, 다양한 세포 유형에 걸쳐 FBS 대체 효율 평가와 함께 물리화학적 특성을 분석함으로써 FBS 대체재로서 TAH의 적용 가능성을 조사하였다.
HaCaT 세포를 이용한 단기 및 장기(10 계대) 배양 실험을 통해 FBS의 70%가 TAH (5 mg/mL)로 대체된 배지(FBS:TAH=3:7)에서 배양한 세포의 성장이 대조군 대비 유의한 차이가 없었으며, 세포의 형태학적 변화 또한 관찰되지 않았다. FBS:TAH (3:7)를 함유한 배지는 다양한 부착 및 부유 세포주를 이용한 배양 실험에서도 대조군과 비교하여 유사한 세포 증식을 보였으며, HaCaT 세포 배양에서 BCS와 TAH를 3:7 비율로 혼합하면 FBS를 완전히 대체할 수 있음이 추가로 확인되었다. 이와 함께 TAH 첨가는 상업용 배지의 pH, 염도 및 색상에 유의한 영향을 미치지 않았으며, TAH는 주로 2 kDa 이하의 저분자량을 가진 물질로 구성되어 있으며 우수한 열 안정성을 나타내는 것으로 확인되었다. TAH는 또한 일반적인 세포 배양 배지가 나타내는 pH 범위에서 높은 제타 전위와 가장 작은 입자 크기를 나타내 FBS 대체물질로 사용하기에 적합한 우수한 제형 특성을 나타냈다. 이러한 결과는 TAH가 FBS의 대체재로서 다양한 세포 유형의 배양에 보편적으로 적용 가능함을 시사한다. 더욱이 TAH는 FBS와 관련된 윤리적, 환경적, 비용 관련 문제를 해결하는 대안으로 가치가 크며, FBS와 관련된 안전 문제를 해결함으로써 배양육 생산에서도 이용될 수 있을 것으로 기대된다.

Fetal bovine serum (FBS) in cell culture technology has expanded globally, serving as a widely used supplement in the formulation of cell culture media given its low globulin and rich growth factor contents compared to sera from other animals. FBS has applications in various life sciences and medical research and related industries including antibody production, stem cell therapy, recombinant protein production, safety evaluation, disease diagnosis, and cultured meat production. As worldwide FBS application in cell culture continues to grow annually, concerns have arisen over its unethical production process, high costs, and environmental issues. Additionally, the possibility of contamination with toxins, mycoplasmas, viruses, and prions during blood collection poses considerable challenges. These issues have prompted recent studies to identify alternatives to FBS for cell culture. In line with this demand, we hypothesized that mealworms (Tenebrio molitor), known for their rich nutritional content, diverse essential amino acids crucial for cell growth, and protective effects against oxidative stress-induced cell toxicity, could serve as potential substitutes for FBS. To evaluate the feasibility of using mealworm protein hydrolysate (TAH) as an FBS alternative, we prepared TAH, evaluated its efficiency across various cell types, and analyzed its physicochemical properties.
Short- and long-term (10 passages) cultivation experiments using HaCaT cells in media where 70% FBS was replaced with TAH (5 mg/mL) (FBS:TAH=3:7) revealed no significant differences in cell growth compared to the control group. No morphological changes were observed. Media containing FBS:TAH (3:7) showed similar cell proliferation to the control group in additional cell culture experiments using various adherent and suspension cell lines. Furthermore, complete replacement of FBS was confirmed by mixing bovine calf serum (BCS) and TAH in a 3:7 ratio for HaCaT cell culture. TAH addition had no significant effect on the pH, salinity, or color of the commercial media. TAH primarily consists of substances with molecular weights below <2 kDa and demonstrates excellent thermal stability. Moreover, TAH exhibited outstanding physicochemical properties with a high zeta potential and the smallest particle size within the pH range typically observed in standard cell culture media. These results suggest that TAH has universal applicability as an FBS substitute for cultivating various cell types and for addressing the ethical, environmental, and cost-related concerns associated with FBS. Its potential use in cultured meat production is also anticipated, as it resolves safety issues related to FBS.

#Fetal bovine serum #mealworm(Tenebrio molitor) #protein hydrolysates

1. Introduction 1
2. Materials and methods 5
2.1. Materials 5
2.2. Preparation of protein hydrolysates and culture media 6
2.3. Microbial contamination analysis 6
2.4. Cell culture 7
2.5. Cell viability assay 8
2.6. Transcriptome analysis 9
2.7. Western blot analysis 10
2.8. Measurement of color, pH, and salinity 11
2.9. Determination of the degree of protein hydrolysis 11
2.10. Determination of total and free amino acids 12
2.11. Gel permeation chromatography (GPC) analysis 13
2.12. Differential scanning calorimetry (DSC) analysis 13
2.13. Zeta potential and particle size analysis 13
2.14. Fourier transform infrared spectroscopy (FT-IR) analysis 14
2.15. Statistical analysis 14
3. Results and discussion 15
3.1. Mealworm protein hydrolysate as an FBS alternative 15
3.1.1. Effect of mealworm protein hydrolysate as a substitution for FBS 15
3.1.2. FBS substitution effect of TAH during long-term culture of 10-generation subcultures 20
3.1.3. A comparative transcriptomic analysis 25
3.1.4. Effects of TAH-substituted media on cell viability for various cell lines 31
3.1.5. Effect of complete substitution of FBS using a mixture of bovine calf serum (BCS) and TAH 34
3.1.6. Effect of TAH-substituted medium on myoblast differentiation 36
3.1.7. Comparison of the FBS substitution effect of protein hydrolysates derived from various edible insects 39
3.2. Physicochemical characteristics of TAH 43
3.2.1. Color, pH, and salinity of TAH 43
3.2.2. Total and free amino acid compositions of TAH 47
3.2.3. Molecular weight distribution of TAH 54
3.2.4. Thermodynamic characterization of TAH by DSC 56
3.2.5. Zeta potential and particle size of TAH 58
3.2.6. FT-IR spectroscopy of TAH 61
4. Conclusions 64
5. References 66
Abstract 74
국문초록 76

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