Optimization of LC-MS/MS analysis methods for ceramides in cosmetics :화장품 내 세라마이드에 대한 LC-MS/MS 분석법 최적화

박수진

학위논문

저자정보: 박수진 (충남대학교, 충남대학교 대학원)

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세라마이드 (Ceramide)는 스핑고지질 (Sphingolipid)에 속해있으며 스핑고이드 염기 (Sphingoid Base, SB) 또는 장쇄 염기 (Long-Chain Base, LCB)와 지방산 (Fatty acid, FA)이 아미드 결합으로 연결된 구조를 가지고 있다. 피부 바깥쪽 각질층에는 가장 다양한 종류의 세라마이드가 존재하고 있어 피부 장벽 항상성 유지를 통한 보호 기능을 수행한다. 이에 피부 질환과의 연관성 및 치료 효과가 연구되어 화장품, 연고 등에 사용되고 있지만 복잡한 샘플 매트릭스 내 세라마이드의 구조적 다양성은 품질 분석을 통한 신뢰도 평가방법의 확립을 어렵게 한다.
본 연구에서는 초고성능 액체크로마토그래피 (Ultra performance liquid chromatography, UPLC)와 결합한 사중극자 비행시간 질량분석기 (Quadrupole Time-of-Flight mass spectrometer, Q-TOF MS)를 이용하여 세라마이드 표준물질의 LC-MS/MS 분석 방법을 확립하고 실제 상업용 원료에서 세라마이드를 분리 및 식별하였다.
세라마이드 NS (d18:1/18:0), NP (t18:0/18:0), AP (t18:0/24:0), EOS (d18:1/30:0/18:2)의 표준물질을 20분의 머무름 시간 내 분리하였으며, MS/MS 스펙트럼을 통해 전구체 이온 (Precursor ion) 및 장쇄 염기 phytosphingosine, sphingosine의 생성 이온 (Product ion) m/z 300, 282, 264가 세라마이드 식별에 특징적임을 확인했다.
최적화된 방법의 검출한계 (Limit of detection, LOD) 및 정량한계 (Limit of quantification, LOQ)는 각각 59~90 ng/mL, 178~360 ng/mL의 범위를 나타냈으며 선형성을 나타내는 결정 계수 R2은 최소 0.994 이상의 값을 얻었다. Intra-day RSD (%)는 1.14~4.43 %, Inter-day RSD (%)는 2.43~4.46 % 이내로 측정되어 방법의 반복성 및 재현성 검증을 통한 정밀성을 증명하였다.
상업용 세라마이드 포함 원료의 분석 결과, 크로마토그램에서 세라마이드 NP (t18:0/18:0) 표준물질의 머무름 시간과 일치하는 피크를 확인하였으며, MS/MS 스펙트럼을 통해 구조적으로도 동일함을 확인하였다. 일치하지 않는 피크에 대해서는 단편화 (Fragmentaion) 패턴에 존재하는 phytosphingosine 생성 이온을 기반으로 전구체 이온의 m/z 차이를 통해 지방산 사슬에 구조적 차이를 가진 세라마이드 IIIB (t18:0/18:1) 및 세라마이드 AP (t18:0/18:0)임을 식별하였다.
따라서 이 연구는 피부 질환과 관리에 대한 연구 및 기술이 발전함에 따라 개발되는 세라마이드 제품의 품질 검증 방법 기초가 될 뿐만 아니라 다양한 매트릭스를 가진 시료에서 분석 방법 개발을 위한 기반으로 활용될 수 있을 것이다.

Ceramide belongs to sphingolipid and has a structure in which sphingoid base (SB) or long-chain base (LCB) and fatty acid (FA) are linked by amide bond. The most diverse types of ceramides exist in the outer stratum corneum of the skin, which performs a protective function by maintaining skin barrier homeostasis. Accordingly, its correlation with skin diseases and therapeutic effects have been studied and it is used in cosmetics and ointments, but the structural diversity of ceramides in complex sample matrices makes it difficult to establish a reliability evaluation method through quality analysis.
In this study, a Quadrupole Time-of-Flight mass spectrometer (Q-TOF MS) combined with Ultra performance liquid chromatography (UPLC) was used to establish LC-MS/MS analysis methods for ceramide standards and to seperate and identify ceramides from actual commercial raw materials.
Standard substances of ceramide NS (d18:1/18:0), NP (t18:0/18:0), AP (t18:0/24:0), and EOS (d18:1/30:0/18:2) were sseparated within a retention time of 20 minutes, and MS/MS spectra confirmed that precursor ions and long-chain base phytosphingosine and sphingosine (Product ion) m/z 300, 282, 264 were characteristic of ceramide identification.
The limit of detection (LOD) and limit of quantification (LOQ) of the optimized method ranged from 59 to 90 ng/mL and 178 to 360 ng/mL, respectively, and the coefficient of determination R2, indicating linearity was at least 0.994. The Intra-day RSD (%) was measured within 1.14 to 4.43%, and the Inter-day RSD (%) was measured within 2.43 to 4.46%, proving the precision through the verification of repeatability and reproducibility of the method.
As a result of analysis of commercial ceramide-containing raw materials, a peak matching the retention time of the ceramide NP (t18:0/18:0) standard was confirmed in the chromatogram, and it was confirmed that they were structurally identical through MS/MS spectra. For mismatched peaks, based on phytosphingosine product ions present in the fragmentation pattern, ceramide IIIB (t18:0/18:1) and ceramide AP (t18:0/18:0) with structural differences in fatty acid chains were identified through m/z differences in precursor ions.
Therefore, this study will not only serve as the basis for quality verification methods for ceramide products that are developed as research and technology on skin diseases and management advance, but can also be used as a basis for developing analysis methods in samples with various matrices.

#Ceramide #Skin #Cosmetics #LC-MS/MS #UPLC #Q-TOF

Ⅰ. 서론 1
1. 세라마이드 (Ceramide) 1
1.1. 세라마이드의 구조 1
1.2. 세라마이드의 기능 3
1.3. 세라마이드의 연구 동향 3
2. 지질체학 (Lipidomics) 5
2.1. 지질체의 분석 5
2.2. LC-MS/MS 기반의 세라마이드 분석 6
Ⅱ. 재료 및 실험 방법 9
1. 재료 및 시약 9
2. 시료 전처리 10
2.1. 표준 용액 제조 10
2.2. 세라마이드 추출 10
3. LC-MS/MS 분석 12
Ⅲ. 결과 및 고찰 13
1. 세라마이드의 LC-MS/MS 분석 13
1.1. 분석 조건 최적화 13
1.2. 방법 검증 22
2. 세라마이드 원료 샘플 분석 26
2.1. UPLC를 이용한 세라마이드의 분리 26
2.2. MS/MS를 이용한 세라마이드의 식별 28
Ⅳ. 결론 33
참고문헌 34
ABSTRACT 39

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