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저자정보
Seol Min-A (국립생태원) Cho Sunghee ((주)툴젠) Jung Young Jun (국립생태원)
저널정보
한국식물생명공학회 Plant Biotechnology Reports Plant Biotechnology Reports 제16권 제5호
발행연도
2022.10
수록면
599 - 611 (13page)
DOI
10.1007/s11816-022-00790-w

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CRISPR–Cas9 gene-editing technology enables efficient genome editing in various plants, but entails difficulties and inef- ficiencies in transforming allotetraploid soybeans. Therefore, for producing transgenic soybeans using high-efficiency CRISPR–Cas9, a method for verifying the mutation efficiency of the target gene guide RNA is essential. Here, we present an experimental method using soybean protoplasts to confirm the effectiveness of single guide RNAs (sgRNAs) and sgRNA clones used for target gene mutagenesis to produce CRISPR–Cas9-mediated transgenic soybeans. In addition, we propose a method to improve the time-consuming process of producing CRISPR–Cas9-mediated transgenic soybeans. First, the fatty acid desaturase 2 (FAD2) gene was selected as a target gene for CRISPR–Cas9 application, and each of the three sgRNAs of the FAD2 isoforms (A, B) was produced based on the corresponding gene sequence. The sgRNAs of the three FAD2 genes were transfected into soybean protoplasts, and next-generation sequencing was performed using the isolated genomic DNA. The two FAD2-1A-1 and FAD2-1B-1 sgRNAs exhibited the highest insertion and deletion (indel) efficiency. Next, the selected FAD2-1A-1 and FAD2-1B-1 sgRNAs were cloned into three different binary vectors, and genomic DNA was isolated after transfection into the protoplast. Indel efficiency was high when pECO202 for FAD2-1A-1 and pECO201 for FAD2-1B-1 were used. Transgenic soybean was produced using the FAD2-1A-1::pECO202 and FAD2-1B-1::pECO201 sgRNA clones. The presented soybean protoplast transformation method can verify the mutation effect of specific sgRNAs and sgRNA clones of the soybean target gene used for CRISPR–Cas9 in a short period of time and reduce the time consump- tion of transgenic soybean production.
#Gene editing · CRISPR–Cas9 · Fatty acid desaturase 2 (FAD2) · Single guide RNA · Soybean protoplasts

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